Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках



 

В эукариотических клетках существует главный регуляторный механизм, делающий инициацию репликации на каждой ОНР возможной один и только один раз за клеточный цикл. Он назван лицензированием. Каждая ОНР в фазах M/G1 получает лицензию на однократную репликацию, и клетка обязательно должна пройти митоз, чтобы получить такую лицензию повторно. Механизм лицензирования критически зависит от погрузки в позднем митозе или в фазе G1 комплекса белков МСМ на ОНР, т.е. от образования предрепликативного комплекса.

Повторная сборка такого комплекса до завершения митоза запрещается несколькими механизмами, в которых важную роль играют протеинкиназы, существенные как раз для прохождения фазы митоза. Ими являются комплекс киназы Cdc28 с циклинами типа В у дрожжей и комплекс киназы Cdk2 с циклинами типов А и Е у высших эукариотов. В клеточном цикле высших эукариотов нестабилен даже комплекс ORC, специфически метящий ОНР. Он дестабилизируется в фазе митоза и повторно образуется только в ранней фазе G1. Более универсальным является освобождение из комплекса с ORC на ОНР белка Cdc6 (погрузчика белков МСМ), которое происходит в фазы S ещё до начала синтеза ДНК. Свободный белок Cdc6 в фосфорилированной протеинкиназами форме подвергается разушению при участии протеасом у дрожжей, а у высших эукариотов транслоцируется из ядра в цитопазму, где и остается до завершения митоза. Поэтому повторная погрузка комплекса МСМ в фазе S становится невозможной. Однако фосфорилирования Cdc6 недостаточно для строгого контроля инициации репликации: гиперпродукция мутанта белка Cdc6 дрожжей, у которого устранены известные сайты фосфорилирования, не вызывает повторной инициации в том же клеточном цикле. Во время фазы S сами белки МСМ в результате фосфорилирования киназой Cdc7-Dbf4 постепенно освобождаются из хроматина и выходят в цитоплазму у дрожжей. У высших эукариотов освобожденные из репликативного комплекса белки МСМ остаются в ядре во время фазы S. Поэтому для предотвращения реинициации требуется дополнительный механизм, состоящий в исчезновении в фазе S лицензирующего фактора RLF-B. Вновь синтезированный белок RFL-B может войти в ядро только после митоза, во время которого ядерная оболочка становится проницаемой для цитоплазматических белков. Таким образом, по меньшей мере 4 механизма используются эукариотическими клетками для предотвращения повторной сборки предрепликативных комплексов до завершения митоза.

Однократное использование ОНР за клеточный цикл вовсе не означает, что инициация синтеза ДНК на всех ОНР в эукариотической клетке происходит одновременно. Уже давно было установлено, что разные области эукариотических хромосом реплицируются в разные характеристические моменты в фазе S. Одни ОНР активируются для инициации рано, а другие поздно. Рано и поздно запускаемые (early and late firing) ОНР сгруппированы в разных кластерах, которые реплицируются в определенные интервалы времени. Временной порядок запуска ОНР остается в целом инвариантным во время последовательных генераций. Рано реплицирующиеся области хроматина цитологически соответствуют R-полосам, содержащим транскрипционно активные гены домашнего хозяства. Напротив, тканеспецифические гены, не экспрессируемые в данной ткани, присутствуют в поздно реплицирующихся G-полосах. Если же в этой ткани такие гены экспрессируются, то они реплицируются рано. Таким образом, рано реплицирующиеся гены находятся в эухроматине, а поздно реплицирующиеся гены – в гетерохроматине. К поздно реплицирующимся сегментам хроматина относятся также области теломер и центромер, транскрипционно инактивированные Х-хромосомы самок и молчащие копии импринтированных генов.

В определении временного порядка запуска ОНР важную роль играет структура хроматина. Об этом свидетельствуют данные, полученные при искусственном перемещении ОНР ARS в хромосомах дрожжей. Установлено, что при переносе поздно запускаемой ОНР из прителомерной области хромосомы в эухроматиновую область эта ОНР начинает реплицироваться рано. Таким образом, не первичная последовательность ДНК ОНР, а структура хроматина определяет расписание использования ОНР для инициации репликации, хотя известны исключения из этого обшего правила.

Изучение кинетики сборки предрепликативных комплексах на ОНР разного типа у дрожжей in vivo показало, что вербовка комплексов МСМ происходит одновременно на ранних и поздних ОНР. Однако последующие этапы связывания белка Cdc45 и погрузки RPA и ДНК-полимераз наблюдаются во время перехода G1®S на рано запускаемых ОНР и значительно отсрочены на поздно запускаемых ОНР. Это позволяет предположить, что решающую роль в расписании репликации во время фазы S играет связывание с лицензированными ОНР белка Cdc45, зависящее от его фосфорилирования. В выяснении механизма этого эффекта важную роль сыграли мутанты дрожжей, дефектные по циклинам Clb5 и/или Clb6. Отсутствие одного Clb6 не повлияло на активацию ОНР. Однако у мутантов Clb5 поздно запускаемые ОНР не инициируют репликацию, и контролируемые ими области хромосомы пассивно реплицируются из отдаленных ранних ОНР. Высказано предположение, что Clb6 участвует только в активации ранних ОНР, а Clb5 требуется для координированного во времени запуска ранних и поздних ОНР. Возможно, специфическое фосфорилирование комплексом Cdc28-Cdc5 необходимо для ассоциации Cdc45 и образования предрепликативных комплексов на поздних ОНР.

Однако циклин-зависимые протеинкиназы клеточного цикла не являются единственными факторами, определяющими раннее и позднее использование ОНР у дрожжей. Существенной является и протеинкиназа Rad53 – плеотропный регулятор контрольных точек повреждения ДНК и репликации ДНК в фазах G1 и S. Мутации в гене RAD53 не только делают клетки более чувствительными к повреждениям ДНК, но и изменяют расписание инициации репликации. Так, у некоторых мутантов rad53 поздние ОНР начинают активироваться более рано в фазе S. Следует отметить, что белок Rad53 физически взаимодействует с Dbf4 и может регулировать активность протеинкиназы Cdc7-Dbf4.

Различная кинетика использования ОНР в одной и той же клетке и возможность обойтись без поздних ОНР за счет активности ранних ОНР помогают понять ещё один аспект регуляции инициации ДНК, характерный для многоклеточных эукариотов. Продолжительность фазы S на разных стадиях развития животных не одинакова: она составляет от нескольких минут в быстро делящихся клетках эмбрионов (на стадии дробления) до нескольких часов в тканях взрослых организмов того же вида. С другой стороны, скорость репликации ДНК в обоих случаях примерно одинакова. Отсюда вытекает логический вывод: для обеспечения репликации генома на разных стадиях развития высшие эукариоты могут использовать разное число потенциальных ОНР, содержащихся в геноме. Для быстрой пролиферации эмбриональных клеток требуется активировать все ОНР, а для медленного роста клеток взрослых тканей можно ограничиться использованием более узкого их подмножества.

 


ЛИТЕРАТУРА

 

1. Messer W. Initiation of DNA replication in Escherichia coli // J. Bacteriol., v. 169, 3395-3399, 1987.

2. Georgopoulos C. The E. coli dnaA initiation protein // Trends Biochem. Sci., v. 5, 319-321, 1989.

3. Skarstad K., Boye E. The initiator protein DnaA: evolution, properties and function // Biochim. Biophys. Acta, v. 1217, 111-130, 1994.

4. Messer W., Blaesing F., Majka J. et al. Functional domains of DnaA proteins // Biochimie, v. 81, 819-825, 1999.

5. Messer W., Blaesing F., Jakimowicz D. et al. Bacterial replication initiator DnaA. Rules for DnaA loading and roles of DnaA in origin unwinding and helicase loading // Biochimie, v. 83, 5-12, 2001.

6. Marczynski G.T., Shapiro L. Bacterial chromosome origins of replication // Curr. Opin. Genet. Devel., v. 3, 775-781, 1993

7. Crooke E. Regulation of chromosomal replication in E. coli: sequestration and beyond // Cell., v. 82, 877-880, 1995.

8. Norris V., Fralick J., Danchin A. A SeqA hyperstructure and its interactions direct the replication and sequestration of DNA // Mol. Microbiol., v. 37. 696-702, 2000.

9. Boye E., Lobner-Olesen A., Skarstad K. Limiting replication to once and only once // EMBO Reports, v. 11, 479-483, 2000.

10. Katayama T., Fujimitsu K., Ogawa T. Multiple pathways regulating DnaA function in Escherichia coli: distinct roles for DnaA titration by the datA locus and the regulatory inactivation of DnaA // Biochimie, v. 83, 13-17, 2001.

11. Newlon C.S. Putting it all together: building a prereplicative complex // Cell, v. 91, 717-720, 1997.

12. Takisawa H., Mimura S., Kubota Y. Eukaryotic DNA replication: from pre-replication complex to initiation complex // Curr. Opin. Cell Biol., v. 12, 690-696, 2000.

13. Ritzi M., Knippers R. Initiation of genome replication: assembly and dissembly of replication-competent chromatin // Gene, v. 245, 13-20, 2000.

14. DePamphilis M.L. Origins of DNA replication // In: “DNA Replication in Eukaryotic Cells”, 1996, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 45-86.

15. DePamphilis M.L. Initiation of DNA replication in eukaryotic chromosomes // J. Cell. Biochem. Suppl., v. 30-31, 8-17, 1998.

16. Bogan J.A., Natale D.A., DePamphilis M.L. Initiation of eukaryotic DNA replication: conservative or liberal // J. Cell. Physiol., v. 184, 139-150, 2000.

17. Bryant J.A., Moore K., Aves S.J. Origins and complexes // J. Experim. Bot., v. 53, 192-202, 2001.

18. Jares P., Donaldson A., Blow J.J. The Cdc7/Dbf4 protein kinase: target of the S phase checkpoint? // EMBO Reports, v. 11, 319-322, 2000.

19. Masai S., Arai K. Cdc7 kinase complex: a key regulator in the initiation of DNA relication // J. Cell. Physiol., v. 190, 287-296, 2002.

20. Dijkwel P.A., Hamlin J.L. Physical and genetic mapping of mammalian replication origins // Methods: a Comparison to Methods in Enzymol., v. 18, 418-431, 1999.

21. Gilbert D.M. Replication origins in yeast versus metazoa: separation of the haves and the haves nots // Curr. Opin. Genet. Devel., v. 8, 194-199, 1999.

22. Francon P., Maiorano D., Mechali M. Initiation of DNA replication in eukaryotes: questioning the origin // FEBS Lett., v. 452, 87-91, 1999.Chevallier S., Blow J.J. Cell cycle control of replication initiation in eukaryotes // Curr. Opin. Cell. Biol., v. 8, 815-821, 1996.

23. Donaldson A.D., Blow J.J. The regulation of replication origin activation // Cur. Opin. Genet. and Devel., v. 9, 62-68, 1999.

24. Littlewood J. Emerging mechanisms of eukaryotic DNA replication initiation // Curr. Opin. Cell Biol., v. 10, 742-748, 1998.

25. Rowles A., Blow J.J. Chromatin proteins involved in the initiation of DNA replication // Curr. Opin. Genet. Devel., v. 7, 152-157, 1997.

26. Hyrien O., Maric C., Lucas I. Role of nuclear architecture in eukaryotic DNA replication // Biochimie, v. 79, 541-548, 1997.

27. Larkins B.A., Dilkes B.P., Dante R.A., Coelho C.M., Woo Y., Liu Y. Investigating the hows and whys of DNA endoreduplication // J. Experim. Bot., v. 82, 183-192, 2001.

 

 




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.