Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Регуляция инициации репликации хромосомы E. coli



 

Контроль инициации репликации хромосомы в области oriC имеет два аспекта. Прежде всего, репликация инициируется в фиксированный момент клеточного цикла, через интервалы, равные времени удвоения клеточной массы. Время, требующееся для полной репликации генома, распределения дочерних хромосом и подготовки клетки к делению, в первом приближении не зависит от скорости роста клеток и составляет около 60 мин при 37о. Если период генерации клеток меньше этого времени (например, в богатых средах), клетки инициируют репликацию хромосомы для следующей генерации ещё до завершения предыдущего раунда синтеза ДНК. Вследствие этого в быстро растущих культурах каждая клетка содержит 2n или 2n+1 ОНР, где n – целое положительное число. Такое число ОНР обеспечивает распределение равного числа хромосом между двумя дочерними клетками при делении. Независимо от числа ОНР, репликация инициируется на всех ОНР в одной клетке одновременно. Механизмы, ответственные за сопряжение репликации бактериальных хромосом с клеточным циклом, пока изучены недостаточно. Предполагается, что инициация происходит при определенной клеточной массе, при которой cоздается критический “потенциал инициации”, т.е.достигается пороговая концентрация свободного белка DnaA в клетке или, скорее, его активной формы, т.е. комплекса с АТФ.

Второй аспект регуляции состоит в том, что каждая копия ОНР oriC в данной клетке используется для инициации репликации только один раз за клеточный цикл. Этот механизм контроля очень важен для жизнеспособности дочерних клеток и изучен более хорошо. Рассмотрим три пути, участвующих в такой регуляции.

· Секвестрирование oriC

Этот механизм определяется состоянием метилирования сайтов GATC в ОНР. В момент инициации репликации эти сайты в днДНК полностью метилированы, что способствует более эффективной инициации. В образовавшихся репликативных вилках вновь синтезированные нити ДНК включают неметилированные основания, так что в днДНК метилирована только родительская нить. В большинстве областей хромосомы метилирование de novo сайтов GATC под действием метилтрансферазы Dam происходит очень быстро (менее чем за 1 мин). Однако в области oriC метилирование сайтов GATC задержано на 13 мин, т.е. на треть клеточного цикла. На гемиметилированных сайтах GATC oriC инициация репликации нормально проходит в системах in vitro, но не идет in vivo. Это позволило предположить существование внутриклеточного фактора, являющегося негативным регулятором инициации и блокирующего (секвестрирующего) гемиметилированные ОНР в состоянии, недоступном как для быстрого метилирования под действием Dam, так и для быстрой реинициации репликации.

Таким фактором оказался белок SeqA длиной 181 остаток, несущественный для жизнеспособности клеток. В мутанте seqA метилирование вновь синтезированной ДНК oriC задержано не на 13 мин, а всего на 5 мин, в результате чего значительно нарушается синхронность репликации на множественных oriC. Белок SeqA преимущественно связывается с гемиметилированными, а не с полностью метилированными и неметилированными 13-мерами в oriC, в начале каждого из которых расположен сайт GATC. Из двух сайтов связывания SeqA в области 13-меров наиболее сильный расположен в 13-мере L. Белок SeqA связывается с этими гемиметилированными сайтами с большим сродством, чем метилаза Dam. К тому же SeqA имеет более высокую концентрацию в клетках, чем Dam, и не смещается с ДНК в присутствии Dam. Поэтому связывание SeqA с областью 13-меров защищает ДНК oriC от метилирования под действием Dam. Такое связывание приводит также к временной ассоциации области Dam c внешней мембраной клетки, поскольку белок SeqA может вести себя как мембранный белок. Связывание с мембраной не зависит от присутствия на ДНК oriC белка DnaА. Однако связывание SeqA с ДНК нестабильно, и через 10 мин связанный белок SeqA диссоциирует от ОНР oriC и делает её доступной для метилирования под действием метилазы Dam. Это приводит к восстановлению полностью метилированного состояния ДНК oriC, благоприятного для инициации.

Второй мишенью для секвестрирования при участии белка SeqA является промоторная область гена dnaA, кодирующего сам белок-иницатор. Она содержит не только блоки oriC, но и один сайт GATC, который после прохождения репликации также надолго задерживается в гемиметилированном состоянии из-за связывания с ним SeqA. Это вызывает временное ингибирование инициации транскрипции гена dnaA и препятствует увеличению концентрации белка DnaA в клетке. На том же уровне работают ещё два механизма предотращения несвоевременной инициации репликации в ОНР oriC.

 

· Pегуляция уровня свободного белка DnaA

Белок DnaA связывается с узнаваемыми им блоками DnaA не только в oriC и в гене dnaA, но и в ещё ~300 cайтах хромосомы E. coli. Эти сайты имеют имеют разное сродство к DnaA и конкурируют с oriC за связывание инициатора, понижая концентрацию свободного белка DnaA в клетке. Среди 5 областей хромосомы E. coli, имеющих наиболее высокое сродство к DnaA, особое положение занимает локус datA, расположенный на 95-ой мин хромосомы и реплицирующийся вскоре после инициации репликации на oriC. Этот локус длиной 950 п.н. содержит 4 блока DnaA, т.е. примерно столько же, как и ОНР oriC и соседний ген mioC, но может оттитровывать в 8 раз больше белка DnaA (300-400 молекул DnaA in vivo). Он неспособен секвестрироваться при участии SeqA, т.к. содержит очень мало сайтов GATC. Сразу после репликации локуса datA, которая происходит примерно в момент окончания секвестрирования oriC, количество связанного с ним белка DnaA удваивается, что приводит к значительному понижению внутриклеточного уровня свободного DnaA на следующем этапе клеточного цикла. Улавливание DnaA локусом datA существенно для регуляции инициации репликации хромосомы. Удаление datA из хромосомы вызывает избыточную инициацию, а повышение числа копий datA в клетке полностью выключает инициацию репликации на oriC. Однако перенос локуса datA в другие положения хромосомы не нарушает функцию datA, так что ранняя репликация datA несущественна для контроля инициации.

 

· Регуляция активности белка DnaA

Сборка скользящих зажимов b-субъединиц ДНК-полимеразы III при инициации репликации на oriC запускает так называемый механизм RIDA регуляторной инактивации DnaA – гидролиз АТФ в активной форме DnaA-АТФ и переход белка-инициатора в неактивную форму DnaA-АДФ. Гидролиз АТФ ускоряется b-субъединицей PolIII и ещё одним недостаточно охарактеризованным белком IdaB. Этот механизм понижает “потенциал репликации”, как только был запущен раунд репликации хромосомы. Однако он недостаточен для предотвращения реинициации в отсутствие секвестрирования oriC и титрования локусом datA.

Период полураспада комплексов DnaA с АТФ или АДФ in vitro одинаков и составляет ~ 1 час. Однако если связанный с ДНК белок DnaA инкубировать в присутствии анионных фосфолипидов, ассоциированные с DnaA нуклеотиды освобождаются очень быстро, и DnaA, утративший связанный АДФ, приобретает способность связывать АТФ и возвращаться в активную форму DnaA-АТФ. Белок DnaA очень часто связывается с клеточной мембраной и взаимодействует в ней с анионными фосфолипидами. Это способствует накоплению комплекса DnaA-АТФ к моменту инициации следующего раунда репликации. Отсутствие в клетке анионных фосфолипидов вызывает неспособность инициировать репликацию хромосомы из oriC.

Таким образом, три разных механизма предотвращают преждевременную реинициацию и вносят вклад в запуск репликации в определенный момент клеточного цикла. Однако пока не доказано, что сочетания только этих механизмов достаточно для строгой регуляции инициации репликации хромосомы E. coli.

 

3.2. Инициация репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.