Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Механизм действия гексамерных ДНК-геликаз



Рассмотрим рабочие модели нескольких последовательных этапов в каталитическом цикле репликативных гексамерных ДНК-геликаз. Эти модели основаны на экспериментальных данных, но во многих деталях остаются гипотетическими.

 

Погрузка гексамерных ДНК-геликаз на ДНК

Для многих кольцевых ДНК-геликаз доказано, что нить онДНК, по которой транслоцируется связанная геликаза, проходит через канал в центре кольца, а не находится на поверхности белка. Поэтому, как и в случае погрузчиков зажима ДНК-полимераз (cм. 1.00), необходимо объяснить, как эта нить попадает внутрь кольца. Доказано, что эта проблема в обоих случаях решается одинаковым образом – по механизму размыкания кольца. Предполагается, что ДНК вначале связывается со первичным слабым сайтом на внешней поверхности кольца ДНК-геликазы (рис. 2.7). Затем кольцо временно размыкается на контактной поверхности между 2 смежными протомерами и нить онДНК попадает внутрь центрального канала, где связывается с более прочным контактным сайтом. После замыкания гексамерного кольца ДНК-геликаза становится способной транлоцировать по онДНК, не отрываясь от неё. Размыкание кольца может происходить спонтанно, но чаще всего облегчается вспомогательными белками – погрузчиками ДНК-геликаз. Так, у фага Т4 погрузке ДНК-геликазы на онДНК, покрытую связывающимся с ней белком gp32, помогает вспомогательный белок gp59. У ДНК-геликазы DnaB E. coli аналогичную роль погрузчика играет белок DnaC.

 

Рис. 2.7. Последовательные стадии связывания и попадания нити онДНК в центральный канал гексамерной ДНК-геликазы

 

В опытах in vitro геликаза DnaB связывается с вилочными субстратами ДНК, имеющими однонитевой 5’-хвост. Вероятно, в этом случае погрузка DnaB на ДНК осуществляется по другому механизму: 5’-онДНК проходит через отверстие кольца DnaB, как нитка продевается в игольное ушко. Однако при инициации репликации in vivo кольцо DnaB должно связаться с внутренним однонитевым участком ДНК, не имеющим свободных концов. Для этого геликаза DnaB нуждается в помощи своего природного партнера –белка DnaС. Этот белок имеет длину 245 остатков (мол. м. 28 кД) и содержит область связывания с DnaB на N-конце и область, содержащую типичные АТФазые мотивы Уокера в С-концевой половине (рис. 2.8). Белок DnaС относится к семейству АТФаз ААА+, подобно погрузчикам скользящего зажима ДНК-полимераз, и может связывать и гидролизовать АТФ.

1 10 70 245

N I II C

Рис. 2.8. Схема организации белка DnaC E. coli.

I – область взаимодействия с белком DnaB,

II – мотивы связывания АТФ

 

Количество белка DnaС на клетку E. coli равно ~20, т.е. совпадает с числом молекул DnaB. Гексамер геликазы DnaB стехиометрически связывает 6 мономеров DnaС в форме со связанным АТФ. Молекулы DnaС располагаются на поверхности одного из оснований кольца DnaB и, вероятно, ассоциируются с С-концевой половиной DnaB. Такое взаимодействие, стабилизируемое АТФ, “замораживает” гексамер DnaB в треугольной конформации с симметрией С3 и закрывает центральный канал DnaB на стороне, противоположной сайтам связывания DnaС. В результате через этот канал не может пройти даже онДНК.

Образование комплекса DnaB-DnaС изменяет свойства обоих партнеров. Белок DnaB утрачивает все свои каталитические активности, включая НТФазную и геликазную, а у белка DnaС активируется его “скрытая” (cryptic) способность связываться с онДНК. В результате комплекс DnaB-DnaС может ассоциироваться с голой онДНК, но не с ДНК, покрытой белком SSB. Этот механизм предотвращает неразборчивую погрузку геликазы DnaB на участки хромосомы, временно ставшие однонитевыми (например, в результате эксцизионной репарации ДНК) и покрытые SSB. Во время инициации репликации хромосомы E. coli в области oriC участки голой онДНК создаются белком-инициатором DnaА (гл.3), за счет взаимодействия с которым белка DnaB на них вербуется комплекс DnaB6-(DnaС-АТФ). После связывания с этими участками белок DnaС каким-то образом размыкает кольцо DnaB и пропускает внутрь него нить онДНК. Вероятно, это происходит так же, как при погрузке зажима ДНК-полимераз g-комплексом погрузчика (см. 1.00). Контакт белка DnaС с онДНК и DnaB запускает гидролиз АТФ, связанного с DnaС, после чего субъединицы DnaС-АДФ покидают комплекс с гексамером DnaB, и он приобретает ДНК-геликазную активность.

 

Cопряжение гидролиза НТФ с транслокацией по онДНК

Гидролиз НТФ ДНК-геликазами используется ими как источник энергии для перемещения по онДНК и для расплетания днДНК. Анализ равновесного связывания нуклеотидов показал, что у многих гексамерных геликаз из 6 субъединиц только три обладают высоким сродством к нуклеотидам, а остальные три имеют низкое сродство и не участвуют в связывании НТФ и в катализе гидролиза. С другой стороны, изучение предстационарной кинетики гидролиза НТФ позволило предположить, что в любой момент времени только одна связанная с гексамером молекула НТФ гидролизуется с высокой скоростью, т.е. три потенциальных каталитических центра в гексамерной геликазе участвуют в гидролизе НТФ не одновременно, а последовательно друг за другом. В этом отношении гексамерные геликазы напоминают другой, хорошо изученный ранее гексамерный фермент – F1-АТФазу мембранных протонных насосов. Последняя состоит из 3 неактивных структурных a-субъединиц и 3 каталитически активных b-субъединиц, которые работают не одновременно. В последовательном механизме действия этой АТФазы реакцию гидролиза АТФ можно разбить на 3 парциальные стадии: связывания АТФ, гидролиза АТФ и освобождения продуктов (АДФ и неорганического фосфата). В любой данный момент времени каждая из этих стадий осуществляется только какой-то одной из a-субъединиц: одна связывает АТФ, вторая гидролизует его, а третья освобождает продукты. В дальнейшем эти субъединицы, согласованно претерпевая последовательные изменения конформации, меняются друг с другом ролями.

Рассмотрим последовательную 3-сайтовую модель действия гексамерных ДНК-геликаз, основанную на аналогии с F1-АТФазой и модифицированную с учетом взаимодействия геликаз с ДНК. Предполагается, что в любой момент времени 3 активные субъединицы геликазы находятся в 3 разных конформационных состояниях. В состоянии Т субъединица связывает НТФ и одновременно имеет высокое сродство к онДНК. В состоянии D она связывает НДФ (продукт гидролиза НТФ) и проявляет более низкое сродство к ДНК, а в «пустом» состоянии Е субъединица свободна от нуклеотидов и онДНК. В первый момент в Т-состоянии находится субъединица 1, в D-состоянии субъединица 2 и в Е-состоянии субъединица 3 (рис. 2.9). Гидролиз НТФ субъединицей 1 вызывает её переход в D-состояние и вызывает одновременное изменение конформации двух остальных субединиц: субъединица 2 освобождает продукты гидролиза и становится «пустой» (переход в Е-состояние), а субъединица 3 связывает НТФ и оказывается в Т-состоянии. Реакция на каждой из субъединиц зависит от реакций, проходящих на 2 остальных субъединицах. Это обеспечивает последовательное протекание 3 стадий катализа (связывания НТФ, гидролиза НТФ и освобождения продуктов) на 3 активных сайтах геликазы. Такие циклы повторяются периодически, и после 3 циклов каждая субъединица геликазы возвращается в исходное состояние.

Рис. 2.9. Схема последовательных изменений состояния индивидуальных субъединиц (1, 2 и 3) в гексамерной ДНК-геликазе.

Т – сайт со связанным НТФ, D – сайт со связанным НДФ, Е – «пустой» сайт

 

Т.к. изменения конформационного состояния субъединиц приводят к изменению их сродства к онДНК, каждая из субъединиц должна последовательно прочно связываться с ДНК в состоянии Т, ослаблять свою ассоциацию с ДНК после гидролиза НТФ и перехода в состояние D , освобожаться от контакта ДНК при передоде в состояние Е и вновь связываться с ДНК, но уже в новом месте, после повторного связывания НТФ и возврата с состояние Т (рис. 2.10, А).

Такая последовательность событий в каждом из 3 сайтов геликазы может обеспечить перемещение ДНК-гелиеказы вдоль ДНК (рис. 2.10, В). В начальный момент времени субъединица 1, находящаяся в состоянии Т и прочно связанная с онДНК, претерпевает изменение конформации, инициирующее движение геликазы. Соседняя субъединица 2, слабо связанная с ДНК в состоянии D, освобождается из контатка с ДНК, а «пустая» субъединица 3 связывает НТФ и прочно связывается с ДНК, но уже в другомсайте. Хотя ДНК освобождается от геликазы в одном месте, в любой момент она остается связанной с двумя субъединицами геликазы. Повторение таких циклов изменения контактов субъединиц ДНК-геликазы с участками ДНК должно привести к однонаправленному процессивному перемещению ДНК-геликазы вдоль онДНК (механизм «активного вращения» - active rolling)

Рис. 2.10. Гипотетическая 3-сайтовая модель транслокации гексамерной ДНК-геликазы по онДНК, сопряженной с НТФазной активностью.

А. Последовательные изменения конформации индивидуальной субъединицы геликазы (I – гидролиз НТФ и ослабление связывания с ДНК, II – диссоциация НДФ и отрыв от ДНК, III – связывание НТФ и прочная ассоциация с новым сайтом в ДНК.

В. Последовательные стадии транслокации геликазы (1, 2 и 3 – номера индивидуальных субъединиц).

Обозначения различных состояний субъединиц – как на рис. 2.9

 

Расплетание днДНК

Этот аспект работы ДНК-геликаз наиболее труден для изучения, и все предложенные механизмы расплетания днДНК остаются гипотетическими. Их можно классифицировать как активные и пассивные, в зависимости от того, участвует ли геликаза в самом акте расплетания или просто стабилизирует участки онДНК. В пассивном механизме ДНК-геликаза косвенно облегчает расплетание, связываясь с онДНК, которая становится доступной в результате временного плавления двойной спирали, вызванного тепловыми флуктуациями на стыке между онДНК и ДНК. В этой модели ДНК-геликаза высупает как разновидность связывающих онДНК и дестабилизирующих дуплекс белков. В пассивном механизме ДНК-геликаза должна связываться с онДНК и однонаправленно перемещаться вдоль неё в направлении днДНК. Транслоцирующаяся ДНК-геликаза улавливает сегменты онДНК длиной в один или несколько нуклеотидов, спонтанно появляющиеся на стыке онДНК-днДНК. Пассивная модель не нашла экспериментального подтверждения. Ей противоречит и способность некоторых ДНК-геликаз связываться не только с онДНК, но и с днДНК.

Активные механизмы расплетания днДНК можно подразделить на три класса. Первые две модели не требуют прочного связывания ДНК-геликазы с днДНК. Модель клина (рис. 2.10, А) предполагает, что одна из расплетенных нитей дуплекса ДНК прочно связана в центральной отверстии кольца гексамерной ДНК-геликазы, а вторая расположена вне кольца и не взаимодействует с белком. При однонаправленном движении геликазы по нити ДНК, проходящей через центральный канал, энергия гидролиза НТФ порождают движущую силу, достаточную не только для перемещения по онДНК, но и для дестабилизации нескольких пар нуклеотидов в днДНК, примыкающей к онДНК. Движущаяся ДНК-геликаза, подобно клину, механически раздвигает эти спаренные основания. Во второй, торсионной модели (рис. 2.10, В) обе разделенные нити ДНК прочно связываются с ДНК-геликазой: одна в центральном канале, а вторая на внешней поверхности кольца. Эти сильные взаимодействия вызывают при транслокации ДНК-геликазы вращение двух нитей ДНК друг относительно друга и генерируют крутящий момент, который раскручивает две нити дуплекса на участке, примыкающем к уже расплетенным нитям. Третья модель активного действия ДНК-геликаз (модель дестабилизации дуплекса) предполагает, что геликаза взаимодействует в центральном канале или на поверхности гексамера не только с онДНК, но и со смежным сегментом дуплекса. Изменения конформации белка, обусловленные гидролизом НТФ, по неустановленному механизму дестабилизируют спираль днДНК в активном центре ДНК-геликазы и вызывают в этой области контакта с днДНК плавление нескольких п.н. После частичного расплетания дуплекса транслоцирующаяся ДНК-геликаза улавливает разошедшиеся нити ДНК. Эта модель похожа на пассивный механизм, но предполагает, что первичное разделение нитей днДНК вызвано не тепловыми флуктуациями, а изменениями конформации ДНК-геликазы.

Рис. 2.11. Гипотетические модели активного расплетания днДНК гексамерными геликазами.

А. Модель клина.

В. Торсионная модель.

С. Модель деспирализации двойной спирали ДНК.





©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.