Общая характеристика геликаз

Геликазами называются ферменты, способные расплетать две комплементарные нити дуплексов нуклеиновых кислот с использованием энергии, полученной при гидролизе 5’-НТФ. Геликазы могут расплетать днДНК (ДНК-геликазы), днРНК (РНК-геликазы) или гибриды ДНК-РНК (например, бактериальный фактор терминации транскрипции Rho). Расплетание шпилечных двунитевых участков РНК играет важную роль в трансляции, сплайсинге и регуляции трапнскрипции. Мы будем рассматривать только ДНК-геликазыы, которые обеспечивают образование однонитевых матриц или интемедиатов ДНК, требующихся для репликации, рекомбинации и репарации ДНК.

ДНК-геликазы являются моторными белками, сопрягающими гидролиз НТФ с дестабилизацией водородных связей в дуплексах ДНК. ДНК-геликазы могут однонаправленно транслоцироваться вдоль нити ДНК независимо от её нуклеотидной последовательности и процессивно расплетать днДНК со скоростью до 500-1000 п.н./сек. Большинство ДНК-геликаз не проявляет строгой специфичности в отношении НТФ и дНТФ.Одни из них чаще использует для геликазной активности дТТФ, другие – ГТФ и АТФ, а третьи предпочитают АТФ. (д)НТФазная активность является обязательным каталитическим свойством геликаз. Энергия гидролиза (д)НТФ используется ими для изменения конформационных состояний молекулы самого фермента во время транлокации и расплетания ДНК.

Почти все ДНК-геликазы предпочитают инициировать расплетание in vitro дуплексов ДНК, имеющих флановую область онДНК, которая облегчает образование комплекса с ДНК («посадку» геликазы на ДНК) и служит сайтом инициации в реакции расплетания. ДНК-геликазы проявляют определенную полярность в расплетании: одни предпочитают дуплекс ДНК с 3’-флаговой, а другие - с 5’-фланговой однонитевой областью. Исключение составляет гетеротримерный фермент репликации RecBCD E. coli, предпочитающий расплетать днДНК с тупыми концами. Остальные ДНК-геликазы являются «полярными». Для определения их полярности используют субстрат ДНК, в контором центальный участоек онДНК фланкирован на обоих концах дуплексными областями (рис. 2.01). Если расплетание происходит в дуплексе А, геликаза имеет полярность 5’®3’. Если же преимущественно расплетается дуплекс В, геликазе приписывают полярность3’®5’. Расплетающая активность некоторых ДНК-геликаз (например, белка DnaB E. coli) стимулируется, если субстрат имеет «вилочную» структуру, т.е. содержит на стыке с дуплексом одновременно 3’- и 5’-однонитевые области. Это показывает, что в структурах репликативных вилок ДНК-геликаза может взаимодействовать с обеими расплетенными нитями ДНК.

A B

5’®3’ 3’®5’

3’ 5’

Рис. 2.1. Схема субстрата ДНК для определения полярности ДНК-геликаз

Все ДНК-геликазы образуют олигомерные активные структуры, преимущественно димеры или гексамеры из одинаковых или (гораздо реже) разных субъединиц. Даже такая ДНК-геликаза, как белок Rep E. coli, в свободном состоянии находящийся в мономерной форме, при связывании с ДНК образует димеры и активна в димерной форме. Главные ДНК-геликазы, участвующие в репликации ДНК, являются гексамерными ферментами.

Компьютерный анализ ДНК-геликаз из различных организмов обнаружил короткие консервативные аминокислотные последовательности, названные “геликазными мотивами”, и позволил разбить эти ферменты на три суперсмейства (SF-1, SF-2 и SF-3) и одно небольшое семейство (F-4). Число таких консервативных мотивов составляет от 3 у суперсемейства 3, в которое в основном входят вируксные геликазы, до 7 у суперсемейств 1 и 2. Два из этих мотивов необходимы для связывания и гидролиза НТФ. Они встретились и ранее у связывающих АТФ белков (в частности, у АТФаз) и были названы мотивами Уокера (J. Walker) типов А и В.

Мотив А с консенсусной последовательностью GK(T/S) образует так называемую Р-петлю в сайте связывания АТФ. Особенно важен остаток лизина (K), боковая аминогруппа которого контактивует с b-фосфатом связанного комплекса Mg²⁺-АТФ и стабилизирует переходное состояние во время катализа. Мотив В содержит инвариантный остаток аспарагиновой кислоты (D), рядом с которым у некоторых суперсемейств расположен второй кислый остаток глутаминовой кислоты (E) в мотиве DExH. Остаток асп координационно связывает ассоциированный с АТФ катион Mg²⁺ и активирует атакующую фосфодиэфирную связь молекулу воды. Эти два мотива АТФазного центра абсолютно необходимы, но не достаточны для геликазной активности. Роль остальных геликазных мотивов не определена однозначно. Некоторые из них могут связывать адениновое кольцо АТФ или g-фосфатную группу НТФ. Другие консервативные мотивы геликаз могут участвовать в ассоциакции ДНК-геликаз с сахарофосфатным остовом или основаниями ДНК или в передаче индукциованных НТФ или НДФ конформационных изменений к сайту связывания с ДНК в геликазе.

Поиски белков, имеющих консервативные геликазные мотивы, в базах данных полностью секвенированных геномов показал, что около 1% генов у всех организмов кодирует потенциальные геликазы. В частности, в геноме E. coli cодержится около 50 таких генов. Свойства и функции главных ДНК-геликаз E. coli приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1

Главные ДНК-геликазы E. coli

Поиск по сайту: