Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Инициация репликации у высших эукариотов



 

3.3.1. Белковые компоненты и путь инициации репликации

 

Гомологи большинства белков S. cerevisiae, участвующих в описанном выше пути инициации репликации (Orc1-Orc6, Cdc6, Mcm2-Мcm7, Cdc7-Dbf4 и Cdc45), сохраняются и у высших эукариотов (дрозофилы, лягушек Xenopus laevis и человека). В отличие от дрожжей, у которых в общем контроле клеточного цикла участвует одна киназа Cdc28, высшие эукаритоы на разных стадиях цикла используют разные циклин-зависимые протеинкиназы. Поэтому следует уточнить, что дрожжевые комплексы Cdc28-Clb5,6 у высших эукариотов заменяются комплексами протеинкиназы Сdk2 с циклинами А и Е.

Особенно интересны свойства эукариотических белков Orc, которые, по аналогии с дрожжами, должны узнавать области начала репликации. Среди S. cerevisiae, дрозофилы и человека эти белки идентичны на 18-27% и гомологичны на 33-39% (табл. 4.1). Исключение составляет наименее консервативный белок Orc6, который у дрожжей не требуется для стабильного связывания ORC c ОНР. Максимальную гомологию проявляют белки Orc4. Более того, дрожжевому белку Orc4, участвующему во взаимодействии с последовательностью ACS, структурно гомологичны белок-инициатор репликации RepA плазмиды из бактерий Pseudomonas и белок Сdc6 из архея Pyrobaculum aerophilum. Это указывает на их консерватизм во всех 3 царствах жизни. Для 5 белков комплекса ORC (Orc1-Orc5) из многих эукариотов выполняется общее правило: их гомология на C-конце выше, чем на N-конце. С-концевые домены этих белков, вероятно, участвуют в гетероолигомеризации при образовании гексамерного комплекса ORC. Так, у человека С-конец Orc2 взаимодействует с Orc3, а С-конец Orc3 необходим для вовлечения в ORC субъединиц Orc4 и Orc5. N-концевые домены белков Orc, предположительно, требуются для взаимодействия с другими клеточными белками или с разными последовательностями ДНК.

Консерватизм основных участников последовательных стадий сборки инициирующих комплексов репликации согласуется и с экспериментальными данными, показавшими, что в общих чертах этапы пути инициации репликации у высших эукариотов такие же, как изображено на рис. 00 для S. cerevisiae. Однако имеются два существенных различия.

Если у почкующихся дрожжей комплекс ORC ведет себя как единое целое и остается связанным с ARS на протяжении всего клеточного цикла, то у млекопитающих этот комплекс разбирается по меньшей мере частично во время митоза и вновь собирается в самом начале фазы G1. Так, белок Orc1 очень слабо ассоциирован с хроматином в митотических клетках млекопитающих и прочно связывается с ДНК в ранней фазе G1 одновременно со сборкой преинициирующего комплекса. Такое временное освобождение Orc1 и, возможно, других компонентов ORC отсрочивает сборку предрепликативного комплекса до завершения митоза и восстановления ядерной структуры. Детали регуляции этого процесса сборки-разборки ORC были уточнены у Xenopus. В этой системе белки Orc освобождаются из хроматина при инкубации с экстрактом из метафазных клеток или с протеинкиназным комплексом Cdc2 – циклин А. Такое освобождение коррелирует с фосфорилированием субъединиц Orc1 и Orc2. Та же самая циклин-зависимая протеинкиназа ответственна и за продвижение клеток в фазу М. Одновременно она блокирует инициацию репликации до завершения фазы митоза, вызывая временную разборку комплекса ORC в конце каждого клеточного цикла.

Второй особенностью пути инициации репликации у высших эукариотов является участие наряду с Cdc6 дополнительного белка – фактора лицензирования репликации RLF-2 – в погрузке комплекса МСМ на ОRC, связанный с хроматином. В яйцах Xenopus RLF-2 также нужен для ассоциации белков Mcm с хроматином, хотя, скорее всего, его главная функция реализуется на более поздней стадии перехода от предрепликативного комплекса к комплексу активной репликации.

 

3.3.2. Проблема существования областей начала репликации у высших эукариотов

 

В отличие от белков аппарата инициации репликации, короткие ARS, идентифицированные у S. cerevisiae, оказались нетипичными для эукариотических ОНР. Даже у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe хромосомные сегменты, обеспечивающие автономную репликацию плазмид, являются гораздо более длинными (~ 1000 п.н.). Типичная минимальная последовательность ARS из S. pombe (рис. 3.9)cодержит 3 критические области (I, II и III). Область I длиной 40 п.н. состоит почти исключительно из остатков А в одной из нитей. Напротив, область III (65 п.н.) в этой нити содержит преимущественно остатки Т (11 повторов ТТТТА). В центральной области II (165 п.н.) имеются короткие отрезки из остатков А или Т и богатый ГЦ сегмент, усиливающий активность ARS. Все 3 области можно заменить на синтетические сегменты поли(дА/дТ) длиной 40 п.н. без понижения активности ARS. По-видимому, для этой активности в ОНР S. pombe необходимы повторы из 3 и более последовательных остатков А или Т. У других видов дрожжей автономную репликацию плазмид обеспечивают более сложные хромосомные фрагменты, включающие не только ОНР, но и похожие на центромерную ДНК последовательности CEN, обеспечивающие правильное распределение плазмид в дочерние клетки.

А.

 

90 40 60 165 330 65 190 (п.н.)





©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.