Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Свойства репликативной ДНК-геликазы DnaB E. coli



 

ДНК-геликаза DnaB имеет длину 471 аминокислотный остаток (мол. масса 52,4 кД) и кодируется геном dnaB (92-ая мин генетической карты). Количество молекул белка DnaB на клетку составляет ~20. Белок DnaB является гексамерной геликазой с полярностью 5’®3’. В репликативных вилках ДНК-геликаза DnaB придает холоферменту ДНК-полимеразы способность вести синтез ДНК с высокой физиологической скоростью (~ 700 п.н./мин). Геликаза DnaB предпочитает вилочные субстраты ДНК, у которых длина 5’-хвоста превышает 20 н., а длина 3’-хвоста – 5 н. Она связывается с 5’-однонитевой областью ДНК со стехиометрией 20±3 н. на гексамер DnaB.

Белок DnaB входит в геликазное семейство F-4, к которому относятся также геликазы gp4 фага Т7 и gp41 фага Т4. Это семейство имеет 4 консервативных геликазных мотива, включая мотивы Уокера типов А и В. Отметим, что аналогичные 4 мотива имеются у главного белка рекомбинации RecA. Молекула DnaB состоит из двух частей: N-концевого домена I с мол.м. 12 кД и С-концевой области доменов III+IV c мол.м. 33 кД (рис. 2.2). Эти части DnaB соединены друг с другом гибким линкером (домен II).

N-концевой домен I имеет преимущественно a-спиральную структуру и участвует в белок-белковых взаимодействиях. С этой областью DnaB связываются белок-инициатор репликации DnaА (см. гл. 3) и праймаза DnaG (см. 2.3). Для взаимодействия с DnaG существенны также линкерная область II и часть домена III. С-концевую часть DnaВ можно разбить на два функциональных домена (III и IV). Центральный домен III может связывать и гидролизовать АТФ в отсутствие других областей DnaВ. В домене III расположены последовательности Уокера типов А (мотив Н1) и В (мотив Н2), входящие в состав НТФазного активного центра DnaВ. В этих мотивах находятся важные для связывания и гидролиза АТФ остатки K237 и T238 в мотиве Н1 и D343 в мотиве Н2. Домен IV содержит дополнительные контактные участки для НТФ и участвует в связывании с ДНК. Для геликазной активности требуются все домены DnaВ.

 

1 22 138 174 345 471

N I II III IV C

                   
         


H1 H1a H2 H3 H4

DnaG DnaA

 

Рис. 2.2. Схема организации функциональных областей ДНК-геликазы DnaB E. coli.

I – маленький N-концевой домен 12 кД, II – гибкий линкер, III+IV – большой С-концевой домен 33 кД, III – домен АТФазной активности, IV – домен взаимодействия с ДНК.

Н1, Н1а, Н2, Н3 и Н4 – консервативные домены геликаз семейства F-4. Указаны главные области взаимодействия с белком DnaА и праймазой DnaG

 

Только N-концевой домен DnaB изучен с высоким разрешением методами рентгеноструктурного анализа и ЯМР. 3-мерная структура всего белка пока установлена лишь методом криоэлектронной микроскопии с разрешением ~20 A. Эти данные показали, что в гексамере белка DnaB субъединицы образуют кольцо диаметром 12,5-14 нм и высотой 5,7 нм. Кольцо имеет центральное отверстие диаметром 3-4 нм, через которое может проийти нить онДНК. Аналогичные размеры имеют и кольца многих других гексамерных ДНК-геликаз. Существуют две взаимопревращающиеся формы кольца DnaB: “треугольник” с 3-кратной симметрией С3 и “пропеллер” с 6-кратной симметрией С6 (рис. 2.3). Взаимопревращение этих форм зависят от белок-белковых взаимодействий и, в частности, от способности N-концевых доменов I смежных субъединиц образовывать димеры. Домены I всех субъединиц расположены на одной и же поверхности основания кольца, а в самом кольце каждая из субъединиц взаимодействует только с 2 ближайшими соседями (рис. 2.4, А).

Структура комплексов белка DnaB с онДНК и вилочными субстратами ДНК изучена методом резонантного флуоресцентного переноса энергии. Эти данные показали, что онДНК действительно проходит через центральный канал гексамера DnaB, а не наматывается на её поверхности. Они позволили предложить модель связывания DnaB с ДНК в репликативной вилке (рис. 2.4, В). “Передняя” часть белка DnaB, обращенная в сторону расплетаемого дуплекса ДНК, образована большими С-концевыми областями всех 6 субъединиц, с которыми взаимодействует участок днДНК длиной не более 2-3 п.н. Две расплетенные нити ДНК на “переднем” краю разделяются друг от друга: 5’-нить попадает в центральный канал кольца DnaB, а 3’-нить “исключается” за пределы гексамера. Во внутреннем канале кольца DnaB

Рис. 2.3. Электронномикроскопические изображения двух гексамерных форм ДНК-геликазы DnaB E. coli: с 3-кратной (слева) и 6-кратной (справа) симметрией

 

Рис. 2.4. Модели гексамера геликазы DnaB E. coli.

А. Домены белка DnaB: 1- глобулярный N-концевой домен I, 2 – линкерный участок II, 3 – удлиненная С-концевая область доменов III и IV.

В. Предполагаемая структура комплекса белка DnaB с вилочным стыком в ДНК. Показано, как 3’-нить онДНК исключается из центрального канала гексамера, а 5’-нить связывается с одной из субъединиц в центральном канале.Стрелкой указано направление движения белка DnaB по ДНК

 

участок расположен участок 5’-нити длиной ~20 н., который, возможно, частично взаимодействует с канавкой в субъединице DnaB, находящейся в данный момент времени в активном состоянии со связанным АТФ (см. стр. 00). 5’-конец 5’-нити ДНК выходит из отверстия кольца через “заднюю” часть, образованную малыми N-концевыми доменами субъединиц DnaB, взаимодействующими с праймазой. Такая организация комплекса благоприятна для прямой передачи расплетенной 5’-нити в качестве матрицы для синтеза РНК-праймеров фрагментов Оказаки.

 




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.