Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

ДНК-полимераза III E. coli



 

Главной репликативной ДНК-полимеразой E. coli является многосубъединичный комплекс ДНК-полимеразы III (PolIII). Самая большая каталитическая a-субъединица PolIII длиной 1160 остатков кодируется существенным геном dnaE и содержится в клетках в ограниченном количестве (10-20 копий на клетку).

Большую часть молекулы белка DnaE (рис. 1-8) занимает полимеразный домен, относящийся к особому бактериальному семейству С ДНК-полимераз. Белок DnaE содержит на самом С-конце (остатки 1000-1073) короткий домен связывания с нуклеиновыми кислотами, имеющий укладку типа ОВ. Семейство белковых доменов ОВ включает домены связывания с антикодоном тРНК некоторых аминоацил-тРНК-синтетаз, домен геликазы RecG, участвующей в репарации ДНК, и домены связывающих онДНК белков SSB бактерий и RF-A эукариотов (см. 2.2).

N-концевая область DnaE (остатки 1-210) состоит из N- и С-доменов (остатки 1-70 и 80-210 соответственно), гомологичных доменам РНР семейства фосфоэстераз – ферментов, гидролизующих фосфоэфирные связи по механизму, зависящему от катионов металлов. Фосфоэстеразная (фосфатазная) активность DnaE потенциально могла бы участвовать в гидролизе пирофосфата – продукта реакции синтеза ДНК. Удаление пирофосфата должно препятствовать обратной реакции пирофосфоролиза ДНК и сдвигать равновесие реакции, катализируемой ДНК-полимеразами, в сторону полимеризации. Однако у большинства известных бактериальных ДНК-полимераз фосфоэстеразный активный центр доменов РНР разрушен заменами аминокислотных остатков, делециями или вставками. Поэтому домены РНР не обладают фосфатазной или 5’-нуклеазной активностью. Сохранение таких мотивов не только у бактериальных ДНК-полимераз III, но и у ДНК-полимераз эукариотов и археев позволило предположить, что они играют существенную роль. И действительно, делеция N-концевых 60 остатков белка DnaE существенно понижает активность PolIII. Высказано предположение, что древние каталитически неактивные фосфоэстеразные домены РНР могут связывать пирофосфат и аллостерически регулировать активность PolIII.

Рис. 1.8. Домены больших субъединиц бактериальных ДНК-полимераз III. A – ДНК-полимеразы DnaE E. coli и Bac. subtilis, B – ДНК-полимераза PolC Bac. subtilis.

1 и 2 – N- и С-концевая часть фосфоэстеразного домена, 3 – ДНК-полимеразный домен, 4 – С-концевой домен с укладкой РНР для связывания с ДНК. У ДНК-полимеразы PolC N-концевая часть фосфоэстеразного домена разорвана вставкой (3’®5’)-экзонуклеазного домена 5

 

a-Субъединица ДНК-полимеразы E. coli не имеет ни 5’-экзонуклеазного, ни (3’®5’)-экзонуклеазного доменов. Тем не менее, PolIII проявляет высокую точность синтеза ДНК и обладает корректорской (3’®5’)-экзонуклеазной активностью. Она обусловлена другой, e-субъединицей – белком длиной 243 остатка, который кодируется геном dnaQ и содержит 6 областей гомологии с (3’®5’)-экзонуклеазными доменами других ДНК-полимераз. Для экзонуклеазной активности существенны 3 первых первые области гомологии в N-концевой части белка DnaQ. Его N-концевой фрагмент длиной 186 остатков проявляет полную экзонуклеазную активность, но не взаимодействует с a-субъединицей PolIII. Для такого связывания необходим С-концевой домен e-субъединицы длиной 57 остатков. Физическая нековалентная ассоциация субъединиц a и e абсолютно необходима для корректорской функции всего комплекса ДНК-полимеразы III. Субъединицы a и e, вместе с самой маленькой субъединицей q, кодируемой геном holE, образуют минимальный фермент, или сердцевину, ДНК-полимеразы III E. coli. В этой сердцевине, обозначаемой как PolIII’,нем e-субъединица взаимодействует с субъединицами a и q, причем во взаимодействии с q участвует N-концевой домен e. Биохимические функции субъединицы q в минимальном ферменте PolIII пока не установлены.

Грамположительные бактерии с низким содержанием ГЦ в ДНК (например, сенная палочка Bacillus subtilis) имеют не одну, а две ДНК-полимеразы III семейства С. Одна из них наиболее гомологична a-субъединицы субъединице PolIII E. coli и названа DnaE. Она также не имеет (3’®5’)-экзонуклеазного домена. Однако в геноме Bac. subtilis не найден гомолог гена dnaQ E. coli. Пока не ясно, как обеспечивается корректорская функция этой ДНК-полимеразы. Возможно, для этого используется какая-то (3’®5’)-экзонуклеаза, не гомологичная белку DnaQ E. coli. Вторая репликативная ДНК-полимераза у Bac. subtilis, кодируемая геном polC, названа PolC. Белок PolC содержит гомологичный белку DnaQ (3’®5’)-экзонуклеазный домен, встроенный в N-мотив РНР (рис. 1.8), и сама обладает корректорской экзонуклеазной активностью. Можно предположить, что общий предок бактериальных ДНК-полимераз семейства С, подобно ДНК-полимеразам семейства В, имел (3’®5’)-экзонуклеазный домен, ковалентно связанный с полимеразным доменом. Этот корректорский домен остался перманентно ассоциированным с полимеразным доменом у ДНК-полимераз PolC грамположительных бактерий и обособился в самостоятельную субъединицу DnaQ у ДНК-полимераз DnaE грамотрицательных бактерий.

Наиболее сложным ансамблем ДНК-полимеразы III E. coli, участвующим в репликации хромосомы, является холофермент PolIII, состоящий из 10 разных субъединиц (a, b, g, d, d’, e, t, q, c и y), кодируемых 9 генами (табл. 1.2). Из клеток E. coli были выделены три разных полимеразных субкомплекса: 1) минимальный фермент aeq; 2) ансамбль III’, содержащий два сердцевинных субкомплекса, прикрепленных к димеру субъединицы t (a2e2q2t2); 3) субкомплекс III*, состоящий из 9 разных субъединиц (a2e2q2t2). Субкомплекс III* отличается от полного холофермента только отсутствием 4 субъединиц b. Общая организация холофермента PolIII представлена на рис. 1.9.

Субкомплексы PolIII синтезируют ДНК с низкой скоростью (10-20 н./сек) и степенью процессивности, равной 10-50. b-Субъединица, кодируемая геном dnaN, является вспомогательным фактором (скользящим зажимом PolIII), обеспечивающим более высокую скорость синтеза (750 н./сек) и процессивность. Включение b-субъединицы в холофермент осуществляется погрузчиком скользящего зажима - g-комплексом g2d1d’1y1c1. Функции b-субъединицы и g-комплекса будут рассмотрены отдельно (см. 1.4). Пока ограничимся только функциями субъединицы t, играющей роль платформы для сборки и поддержания общей структуры холофермента PolIII.


 

 

Рис. 1.9. Общая схема организации холофермента ДНК-полимеразы III E.coli

 

Субъединицы t и g («белки DnaX») кодируются одним и тем же геном dnaX и являются альтернативными продуктами трансляции его мРНК. Полноразмерным продуктом трансляции является субъединица t длиной 643 аминокислотных остатка. Во внутренней области мРНК dnaX имеется сайт трансляционного сдвига рамки – «скользкая» последовательность из 6 смежных остатков A, за которой расположена стабильная шпилечная структура (рис. 1.10). На таком сайте рибосомы часто (с вероятностью 10-20%) проскальзывают во время трансляции на один кодон назад, в 5’-сторону и продолжают трансляцию в новой открытой рамке считывания -1. В мРНК dnaX в этой альтернативной рамке они декодируют только один кодон GAG глутаминовой кислоты, а затем попадают на стоп-кодон UAG, на котором трансляция терминируется. Продуктом такого рибосомного сдвига рамки является белок g длиной всего 431 остаток. За исключением С-концевого остатка глу, он идентичен N- концевым 2/3 субъединицы t.

……………………………………………………….ЛизГлу*** Рамка -1
……………………………AAAGCAAAAAAGAGUGAAA…………….
Начало шпильки

 

Рис. 1.10. Трансляционный сдвиг рамки считывания при трансляции мРНК гена dnaX E. coli

Указано положение скользкой последовательности AAAAAA и начала стабильной шпильки мРНК. *** - терминация трансляции на кодоне UGA в рамке считывания -1

 

DnaB

 

Рис. 1.1011. Доменная организация субъединиц t (А) и g (В) холофермента ДНК полимеразы III E.coli.

Указаны области субъединицы t, участвующие в связывании субъединицы a , dd’ и yc холофермента ДНК-полимеразы III и ДНК-геликазы репликативной вилки DnaB, а также область субъединицы g для связывания комплексов dd’ и cy и белка скользящего зажима DnaB. RFC – участки гомологии с субъединицами эукариотического фактора RFC

 

Ограниченный протеолиз полноразмерного продукта гена dnaX позволил разбить его на 5 доменов (рис. 1.11). Первые три домена являются общими для субъединиц t и g. N-концевая область 1 образует АТФазный домен, функции которого мы рассмотрим при анализе работы комплекса скользящего зажима (см. 1.4). Общая центральная область 3 содержит участки взаимодействия, необходимые для образования димера субъединиц t и для связывания с ним g-субъединицы. С этой областью в белке g ассоциируются остальные субъединицы комплекса погрузчика. Белки d и c прямо связываются с g. В свою очередь субъединицы d и y образуют субкомплексы со стехиометрией 1:1 с субъединицами d’ и c соответственно и служат мостиками между d’ и c и белком g. Связывание субкомплекса cy повышает сродство g к субкомплексу dd’.

Два последних домена (4 и 5) целиком имеются только у белка t. С-концевой домен 5 длиной 147 остатков играет наиболее важную роль в образовании димерной ДНК-полимеразы III. В димере t2 каждая из субъединиц t связывает по одной субъединице a сердцевины PolIII. Такое взаимодействие обеспечивает ассоциацию двух ДНК-полимераз, одна из которых участвует в синтезе ведущей, а вторая – в синтезе отстающей нити ДНК в реплисоме. Домен 4 состоит из короткой N-концевой части, имеющейся у белков t и g, и уникальной С-концевой части длиной 66 остатков, имеющейся только у белка t. Именно с этой уникальной областью и связывается ДНК-геликаза репликативной вилки – белок DnaB (см. 2.1). Во взаимодействии ДНК-полимеразы III с гексамерным белком DnaB участвуют обе субъединицы димера t2. Это обеспечивает дополнительную связь между ДНК-полимеразами ведущей и отстающей нитей, важную для динамики репликативного комплекса.

 


 




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.