Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Бактериальные ДНК-полимеразы



Характеристики главных типов бактериальных ДНК-полимераз наиболее детально изучены на примере E. coli (табл. 1.2). Всего у кишечной палочки существуют 5 разных ДНК-полимераз. Мы рассмотрим вначале только три из них, отложив характеристику двух «склонных к ошибкам» ДНК-полимераз до гл. 00.

 

Таблица 1.2

ДНК-полимеразы E. coli

ДНК-полимеразы Ген Положение на карте, мин Продукт Число остатков Мол. масса кД Функция
ДНК-полимераза I (A) polA 87,2 PolI Репарация, репликация
ДНК-полимераза II (B) polB 1,4 PolII Репарация, мутагенез
  Главная репликативная ДНК-полимераза III (C)   dnaE 4,4 a, PolIII Каталитическая субъединица
dnaN 83,6 b, PolIII Скользящий зажим
dnaQ 5,1 e, PolIII (3’®5’)-экзонуклеазная субъединица
dnaX 10,6 t, PolIII g, PolIII Структурная субъединица
Комплекс g-комплекса погрузчика зажима
holA 14,4 d, PolIII
holB 24,9 d’, PolIII
holC 96,6 c, PolIII
holD 99,3 y, PolIII
holE 41,5 q, PolIII Компонент минимального фермента

 

 

1.2.1. ДНК-полимераза I E.coli

 

Из всех ДНК-полимераз E. coli наиболее высокий внутриклеточный уровень (~ 400 молекул на клетку) имеет ДНК-полимераза I, кодируемая существенным геном polA. Она состоит из одной субъединицы длиной 928 остатков, которую можно разделить на три домена (рис. 1.6). N-концевую треть молекулы занимает (5’®3’)-экзонуклеазный домен, в центре расположен самый короткий (3’®5’)-экзонуклеазный домен, а самый большой полимеразный домен находится на С-конце. При ограниченном протеолизе ДНК-полимеразы I расщепление на границе между первыми доменами дает малый N-концевой 5’-нуклеазный фрагмент и большой С-концевой фрагмент, который называется кленовским фрагментом. Последний сохраняет 3’-нуклеазную и полимеразную активность и часто используется для синтеза ДНК in vitro.

(3’®5’)-экзонуклеазный домен, ответственный за корректорскую активность ДНК-полимеразы I, не является обязательным и отсутствует у бактерий из родов Thermus и Rickettsia. Остальные два домена жизненно важны для клеток и обеспечивают участие ДНК-полимеразы I в процессах репарации и удаления рибонуклеотидной части фрагментов Оказаки в отстающей нити. Поэтому делеция гена polA летальна для E. coli, а нелетальные мутации понижают в 10 раз скорость соединения фрагментов Оказаки и повыщаютповещают чувствительность клеток к агентам, повреждающим ДНК.

 

Рис. 1.6. Доменная с

труктура ДНК-полимеразы I E.coli.

A – взаимное расположение доменов. I – 5’-нуклеазный домен, II – (3’®5’)-экзонуклеазный домен, III – ДНК-полимеразный домен. Стрелка соответствует кленовскому фрагменту ДНК-полимеразы I.

B – мотивы полимеразного домена, консервативные среди бактериальных ДНК-полимераз I.

Эти мотивы имеют следующие консенсусные последовательности: 699hhhhDhhxEhx712 (A), 754RpxxKxxxhGhhY766(B) и 876hhxhHDЕhxxЕ888 (С) - , где h – гидрофобный остаток, х – произвольный остаток, р – преимущественно R (нумерация остатков ДНК-полимеразы I E. coli)

 

Полимеразные домены различных ДНК-полимераз I и ДНК-полимеразы фага Т7 очень похожи друг на друга и содержат 6 консервативных участков, среди которых три аналогичны консервативным мотивам А, В и С главного семейства В эукариотических ДНК-полимераз и играют наиболее важную роль во время синтеза ДНК. Мотивы А и С ДНК-полимеразы I E. coli содержат кислые остатки асп705 и асп882 соответственно, связывающие катионы Mg+ в каталитическом активном центре (см. рис. 1.1В), а мотив В включает инвариантный положительно заряженный остаток (арг758) и ароматический остаток (тир766). Эти три мотива являются элементами полости, с которой связывается включающийся дНТФ в активном полимеразном центре.

-

Рис. 1.7. Модель трехмерной структуры полимеразного домена ДНК-полимеразы I E.coli.

Указаны положения, в которых начинаются консервативные мотивы А, В и С

 

 

Рентгеноструктурный анализ кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I E. coli впервые обнаружил специфическую архитектуру полимеразного домена, который по форме напоминает кисть правой руки (рис. 1.7) и состоит из пространственных доменов «ладони» (palm), «большого пальца» (thumb) и «пальцев» (fingers). Аналогичную трехмерную организацию имеют и все изученные экспериментально полимеразные домены других ДНК-полимераз и обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека. Можно предположить, что так же организованы и полимеразные домены большинства ДНК-полимераз. Наиболее консервативна топология домена ладони, состоящего из b-слоя, фланкированного двумя a-спиралями. В домене ладони расположены консервативные мотивы А и С. Домены большого пальца и пальцев у ДНК-полимеразы I E. coli образованы a-спиралями, причем спираль О домена пальцев совпадает с мотивом В. У других ДНК-полимераз организация этих доменов гораздо менее консервативна. Хотя домен больших пальцев остается преимущественно a-спиральным, но тонкие детали его топологии неодинаковы. Еще более велики различия доменов пальцев. В целом, для архитектуры полимеразного домена характерно существование внутренней полости для связывания матрицы-затравки ДНК и входящего дНТФ, основанием которой является домен ладони.

На примере бактериальной ДНК-полимеразы Iмы рассмотримпоследовательные изменения конформации этой полости во время полимеразного каталитического цикла. Эти рентгеноструктурные данные были получены для нескольких свободных бактериальных полимераз и их комплексов с ДНК в присутствии и в отсутствие дНТФ. Вероятно, такие же изменения происходят во время работы других ДНК-полимераз. «Рабочий цикл» состоит из 4 последовательных стадий: 1) связывания ДНК-полимеразы с матрицей-затравкой ДНК; 2) связывания с комплексом полимераза-ДНК подходящего дНТФ, комплементарного первому остатку матрицы; 3) нуклеофильной атаки, приводящей к образованию фосфодиэфирной связи; 4) освобождения пирофосфата. Первые две стадии протекают очень быстро, и общую скорость полимеризации лимитирует стадия 3 или предшествующее ей изменение конформации.

Первая стадия сопровождается конформационными изменениями домена большого пальца, который поворачивается в сторону домена ладони. Одновременно изменяется положение спиралей Н1 и Н2 на конце большого пальца, которые сближаются с днДНК. В результате из домена большого пальца и прилежащей части домена ладони образуется цилиндрический канал диаметром 30 Å, охватывающий дуплекс ДНК. В нем аминокислотные остатки ДНК-полимеразы контактируют с ДНК по малой канавке. Взаимодействия с ДНК полимеразой вызывают изменения конформации как в днДНК (изгиб на расстоянии 3 п.н. от праймерного конца), так и однонитевой затравке, первый нуклеотид которой поворачивается на угол >90о, а следующие основания – на 180о. Этот переход матричной нити в S-образную конфигурацию смещает первый матричный нуклеотид с оси дуплекса ДНК, на которой вместо него оказывается остаток тир766 спирали О домена пальцев.

Второе изменение конформации происходит после связывания дНТФ и в основном затрагивает домен пальцев и смежную область домена ладони. Домен пальцев поворачивается в сторону 3’-конца затравки, а его О-спираль с мотивом В вращается на 40о в сторону двух остатков асп каталитического центра. В результате сайт связывания дНТФ переходит из «открытой» формы в «закрытую». Первый остаток матрицы возвращается на ось днДНК, вытесняя с нее остаток Y766, сохраняющий стэкинг-взаимодействие с этим матричным нуклеотидом. В «закрытой» форме входящий дНТФ образует уотсон-криковскую пару с первым матричным основанием. В стабилизации этой пары участвуют также взаимодействие ароматических колец остатков фен и тир с мотиве В с азотистым основанием дНТФ и гидрофобные взаимодействия боковых цепей остатков или и глу с дезоксирибозой. Положительно заряженный остаток арг758 мотива В взаимодействует с отрицательно заряженным трифосфатом дНТФ, а остатки асп705 и асп882 активного центра в домене ладони при участии двух катионов Mg2+ устанавливают правильную геометрию трифосфата дНТФ, необходимую для нуклеофильной атаки 3’-концом затравки (см. рис. 1.1В). Таким образом, замкнутая структура белка, удерживающая в правильной конфигурации пару дНТФ-матричное основание, создается конформационными изменениями ДНК полимеразы в соответствии с моделью ииндуцированногоиндуцированного соответствия.

После включения очередного нуклеотида в растущую цепь ДНК полимераза возвращается в «открытую» форму, транслоцируется к следующему положению матрицы и освобождает пирофосфат. В освобождении пирофосфата важную роль играет взаимодействие остатков арг и лиз в О-спирали с a- и b-фосфатными группами. Изменение положения этих основных остатков во время перехода в открытую форму способствует удалению пирофосфата из каталитического центра и предотвращает обратную реакцию пирофосфоролиза ДНК.

 




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.