Биосинтез ДНК. Общие определения

Калинин Виталий Леонидович. Репликация генома

СОДЕРЖАНИЕ

ГЛАВА 1. ДНК-полимеразы

Биосинтез ДНК. Общие определения

Бактериальные ДНК-полимеразы

ДНК-полимераза I E.coli

ДНК-полимераза II E.coli

ДНК-полимераза III E. coli

Эукариотические ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы археев

ДНК-полимераза a

ДНК-полимераза b

ДНК-полимераза g

ДНК-полимеразы d и e

ДНК-полимеразы археев

Скользящие зажимы ДНК-полимераз и их погрузчики

Скользящие зажимы – факторы процессивности ДНК-полимераз

Погрузчики скользящего зажима

Белки ААА⁺

g-Комплекс погрузчика зажима ДНК-полимеразы III E. coli

ЛИТЕРАТУРА

ГЛАВА 2. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ БЕЛКИ РЕПЛИКАЦИИ ДНК

ДНК-геликазы

Общая характеристика геликаз

Свойства репликативной ДНК-геликазы DnaB E. coli

ДНК-геликаза репликативной вилки у эукариотов

Механизм действия гексамерных ДНК-геликаз

Погрузка гексамерных ДНК-геликаз на ДНК

Cопряжение гидролиза НТФ с транслокацией по онДНК

Расплетание днДНК

Белки, связывающие однонитевую ДНК

Праймазы

ДНК-лигазы

ДНК-топоизомеразы

ЛИТЕРАТУРА

ГЛАВА 3. Инициация репликации хромосомной ДНК

3.1. Инициация репликации хромосомы E. coli

Белок-инициатор DnaA

Минимальная область начала репликации oriC y E.coli

Этапы инициации репликации на ОНР oriC

Регуляция инициации репликации хромосомы E. coli

3.2. Инициация репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Области начала репликации (ОНР) ARS и комплекс узнавания ОНР (ORC)

Этапы пути инициации репликации на ОНР у дрожжей

Инициация репликации у высших эукариотов

Белковые компоненты и путь инициации репликации

Проблема существования областей начала репликации у высших эукариотов

Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках

ЛИТЕРАТУРА

ГЛАВА 1. ДНК-полимеразы

Биосинтез ДНК. Общие определения

ДНК, служащая первичным носителем генетической информации, является линейным или кольцевым гетерополимером, состоящим из 4 дезоксирибонуклеотидов (dA, dT, dG и dC), соединенных (3’®5’)-фосфодиэфирными связями. ДНК чаще всего находится в форме двойной спирали Крика-Уотсона (даунитевая двунитевая ДНК, или днДНК), в которой две нити спарены друг с другом водородными связями с соблюдением правила комплементарности (остатки А спарены с Т, а остатки G c C). Лишь у некоторых фагов и эукариотических вирусов геномная ДНК может находиться в однонитевом состоянии. Однако участки однонитевой онДНК (бреши) могут возникать в процессах репарации и рекомбинации в днДНК.

Под биосинтезом ДНК в широком смысле слова понимается ферментативное удлинение нити ДНК хотя бы на один нуклеотидный остаток с использованием в качестве субстратов дезоксирибонуклеотид-5’-трифосфатов (5’-дНТФ). Соединение друг с другом сегментов нити онДНК, катализируемое ДНК-лигазами, также вызывает удлинение нити, но не сопровождается синтезом ДНК de novo. Синтез нитей ДНК идет в направлении от 5’-конца к 3’-концу, т.е. добавление каждого нового нуклеотида увеличивает длину вновь синтезируемой нити на один остаток со стороны 3’-конца (рис. 1.1, А).

Синтез ДНК катализируется ферментами, относящимися к общему классу нуклеотидилтрансфераз, которые вызывают перенос нуклеотида на акцепторную ОН-группу. Большинство ферментов, катализирующих биосинтез ДНК, являются матричными ферментами: они копируют исходный «родительский» полинуклеотид (матрицу) с образованием комплементарной матрице нити вновь синтезированной ДНК. Исключение составляют терминальные дезоксинуклеотидилтрансферазы, нематричным образом присоединяющие нуклеотид к 3’-концу даже изолированной онДНК. Ферменты, использующие в качестве матрицы нить ДНК, называются ДНК-полимеразами. Ферменты, использующие для синтеза нити ДНК матрицу РНК, называются РНК-зависимыми ДНК-полимеразами, или обратными транскриптазами. Обратные транскриптазы используются для синтеза ДНК ретровирусами и параретровирусами и подвижными ретроэлементами в геномах преимущественно эукариотов. К обратным транскриптазам относится и теломераза, участвующая в сохранение терминальных областей линейных эукариотических хромосом (см. гл. 00). Все эти полимеразы во время синтеза ДНК перемещаются по матричной нити полинуклеотидов в направлении 3’®5’. Важной характеристикой ферментов синтеза ДНК является процессивность – способность фермента последовательно осуществлять многие каталитические акты без отрыва от матрицы после каждого из них. Степень процессивности определяется числом нуклеотидных остатков, включенных в растущую цепь за всю серию таких непрерывных актов полимеризации. Полимеразы, отрывающиеся от матрицы после каждого акта включения нуклеотида в растущую цепь, называются дистрибутивными.

Механизм реакции полимеризации нуклеиновых кислот является общим для всех ДНК-полимераз, обратных транскриптаз и РНК-полимераз и состоит в нуклеофильном атаке замещении типа S_N2 b,g-пирофосфатной части 5’-(д)НТФ 3’-атомом кислорода 3’-концевого остатка РНК или ДНК (рис. 1.1, А). В результате этой реакции новый остаток (д)НМФ присоединяется к 3’-концу цепи и освобождается неорганический пирофосфат PP_i. В промежуточном (переходном) состоянии в этой реакции атом Р a-фосфатной группы НТФ имеет пентаковалентную конфигурацию (рис. 1В). Он расположен в центре треугольной бипирамиды, в экваториальной плоскости, в которой находится треугольник атомов О a-фосфатной группы, а в апикальных положениях - 3’-атом О^- растущей цепи ДНК и атом O a,b-связи дНТФ. Образование такой структуры обеспечивается 2 катионами Mg²⁺. Атом КатионА. А понижает рК_a у 3’-ОН-группы и превращает ее в группу 3’-O^-, а также стабилизирует угол 90^o между связью 3’-O^- - P и экваториальной плоскостью. Катион В также стабилизирует геометрию переходного состояния и способствует уходу пирофосфатного продукта. Оба катиона Mg²⁺ координационно связаны с карбоксильными группами остатков асп или глу в полимеразе.

Выравнивание первичных аминокислотных последовательностей, предсказанных на основании данных секвенирования структурных генов, позволил разбить все известные ДНК-полимеразы на 6 больших гомологических семейств гомологии. Четыре Три из этих семейств содержат как прокариотические, так и эукариотические ДНК-полимеразы. Семейство С встречается только у эубактерий, семейство D – только у архееев и семейство Х

A. ДНК дНТФ

5’ Bn-1 O CH2     H O 3’ | + HO-P=O | O 5’| Bn O CH2 H OH 3’

5’ Bn-1 O CH2     H O 3’ | HO-P=O | O Bn O CH2 + PPi

H O

|

a HO-P=O

5’ |

B_s+1 О

|

O CH₂

|

H OH 3’