Методи вивчення функціональної активності клітин

Ця група включає різноманітні методи, що застосовуються для оцінки фізіологічного стану клітин імунної системи під впливом різних речовин або чужорідних клітин.

Реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ)

РБТЛ дозволяє оцінити готовність лімфоцитів “відповідати” на антиген. Відповідь на антиген моделюють за рахунок додавання різних стимуляторів (мітогенів, антигенів), в результаті чого малі лімфоцити перетворюються у бласты – великі клітини, що активно діляться і диференціюються. В процесі бласттрансформації відбуваються морфологічні та фізіологічні зміни лімфоцитів – збільшення ядра, підвищення кількості мітохондрій, лізосом та рибосом, активація біосинтетичних процесів.

В якості стимуліторів бласттрансформації лімфоцитів звичайно застосовують мітогени – речовини, які підвищують інтенсивність мітозів. На практиці як стимулятори бласттрансформації найбільш часто використовують:

– рослинні мітогени: фітогемагглютінін (ФГА), конканавалін А (Кон А), митоген лаконоса (МЛ);

– мікробні мітогени: бактеріальні ліпополісахаріди (ЛПС), ферменти, екстракти з клітин стафілокока та стрептокока, білок А стафілокока, туберкулін мікобактерій, компоненти капсул, джгутиків, клітинних стінок тощо;

– мітогени тваринного походження: чужорідні Ig та ін.

Перелічені мітогени розрізняються інтенсивністю дії у відношенні різних популяцій лімфоцитів. Так, ФГА і Кон А стимулюють Т-лімфоцити, ЛПС бактерій (Е. coli, сальмонел та ін.), туберкулін, декстрани, імуноглобуліни стимулюють бласттрансформацію переважно В-клітин. Митоген лаконоса стимулює клітини обох типів. Таким чином, підбираючи мітогени, можна вивчати функціональну активність окремих субпопуляцій лімфоцитів.

При постанові реакції до суспензії лімфоцитів додають розчин мітогена у нетоксичній для клітин концентрації. Після інкубації (при 37°С) проводять лізис еритроцитів (якщо використовується цільна кров) і підраховують кількість клітин, що трансформувалися у бласти. Аналіз результатів проводять візуально у пофарбованих мазках, або по зміні радіоактивності лімфоцитів, що входять у мітотический цикл (при попередньому введенні радіоактивного 3Н-тімідина у клітини). Для підрахунку “радіоактивних” клітин використовують автоматичний сцинтіляційний лічильник. Для оптимального протікання РБТЛ необхідна присутність макрофагів, тому високоочищені лімфоцити звичайно не використовуються. Постановка реакції і культивування повинні здійснюватися в стерильних умовах. Тому використання РБТЛ у клініці для кількісної оцінки субпопуляцій лімфоцитів у даний час у значній мірі утратило своє значення в зв'язку з появою більш простих методів (розеткоутворення, мембранної иммунофлуоресценції з міченими моноклональними антитілами, стрептавідін-біотинового методу й ін.). Однак досить великим залишається значення бласттрансформації для визначення фізіологічної активності (проліферативного потенціалу) клітин як на неспецифічні активатори (мітогени), так і на специфічні (антигени найпростіших, грибів, бактерій, вірусів, тканин організму).

14.3.2. Визначення цитотоксичної активності лімфоцитів

Даний метод призначений для оцінки кілерної активності великих гранулярних лімфоцитів, в основному природних кілерів (NK-клітин) і К-клітин, здатних реалізувати антитілозалежну клітинну цитотоксичность (АЗКЦТ). Перелічені клітини не тільки in vivo, а й in vitro здатні руйнувати клітини-мішені, на поверхні яких експресовані чужорідні, або змінені власні антигени (див. розд. 6, Реакції кілингу). При постанові реакції лімфоцити, очищені від моноцитів і гранулоцитів (також викликають лізис клітин-мішеней) инкубують із кліткинами-мішенями. Цитотоксичний ефект визначають у декілька способів: 1) підраховуючи кількість живих клітин-мішеней, що залишилися; 2) оцінюючи морфологічні зміни клітин-мішеней; 3) по появі радіоактивного ізотопу 51Сг, який викидується у культуральне середовище при руйнуванні клітин-мішеней. Звичайно беруть кілька проб з різними співвідношеннями лімфоцитів і клітин-мішеней.

При визначенні К-клітин по реакції АЗКЦТ як клітини-мішені звичайно використовують еритроцити тварин або інші клітини (наприклад, клітини мастоцитоми мишей, резистентні до лізису моноцитами і гранулоцитами). Оскільки кілинг у даному випадку здійснюється у присутності антитіл, завчасно проводять сенсибілізацію еритроцитів антиеритроцитарними антитілами, міченими ⁵¹Сг. Для цього проводять інкубацію з розчином Nа₂⁵¹СrO₄ або Nа₂⁵¹Сr₂O₇. Лімфоцити инкубують із сенсибілізованими клітинами-мішенями протягом 2-24 години. В результаті лізису клітин-мішеней у середовище виділяється радіоактивний хром, кількість якого пропорційна рівневі цитотоксичності лімфоцитів.

Визначення активності природних кілерів (NK-клітин) здійснюють при використанні в якості клітин-мішеней пухлинних клітин, культивованих in vitro (наприклад, мієлоідну лінію К-562, лінії Р-4788, М-Hela та ін.). Клітини-мішені мітять солями радіоактивного ізотопу ⁵¹Сr. Лімфоцити инкубують із клітинами-мішенями протягом 3-24 ч. Активність NK-клітин оцінюють по виділенню у культуральне середовище радіоактивного ізотопу. Дані методи вимагають складної апаратури й умов роботи з ізотопами, тому застосовуються переважно в спеціалізованих лабораторіях.

Поиск по сайту: