Реакція преципітації та її варіанти

ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ

Імунологічні методи – це група методів, які базуються на реакції “антиген – антитіло”. Вони використовуються для якісного та кількісного виявлення гуморальних або клітинних факторів імунної системи.

Антитіла, як специфічні реагенти для виявлення антигенних субстанцій, почали застосовувати ще на початку ХХ ст., у лабораторну діагностику інфекційних хвороб поступово впроваджувались методи, засновані на реакціях аглютинації, преципітації, зв’язування комплемента. У 30–70 роках удосконалювались методи візуалізації комплексів “антиген – антитіло”, були розроблені методи преципітації в гелі (методи Оухтерлоні та Манчині для визначення Ig). В останні десятиріччя ХХ ст. на основі реакцій “антиген – антитіло” були розроблені нові, дуже специфічні і чутливі методи, такі як:

· Імуноелектрофорез;

· Імуноблотинг;

· Імуноафінна хроматографія;

· Реакції імунофлюоресценції (РІФ) у прямому та непрямому варіантах;

· Імуноферментний аналіз (ІФА);

· Радіоімунний аналіз (РІМ);

· Методи з використанням моноклональних антитіл.

Слід відмітити, що імунологічні методи використовуються не тільки у клінічній діагностиці, а й в фундаментальних дослідженнях. Вони стали невід’ємною частиною білкової хімії, молекулярної біології, генетики, мікробіології, вірусології, гістохімії, онкології тощо. Значне місце у вивченні факторів імунної системи і виявлені різноманітних імунологічно активних молекул зараз займають молекулярно-генетичні методи: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР); саузерн-блот (визначення ДНК); нозерн-блот (визначення РНК).

Всі імунологічні методи можна розділити на дві великі групи. Перша група включає серологічні методи, які базуються на реакції “антиген – антитіло” і дозволяють виявляти молекули на поверхні клітин або у сироватці крові за допомогою реакцій преципітації, аглютинації, імунофлуоресценції, імуноферментного аналізу та ін.. Друга група поєднує методи вивчення клітинного імунітету шляхом визначення кількості клітин різних субпопуляцій імуноцитів, функціональної активності клітин під впливом різних речовин (мітогенів, антигенів й ін.) з наступним визначенням ступеня їхньої активації та виконання тієї або іншої функції. Крім того, існують змішані методи тестування клітин, в яких використовуються принципи методів перших двох груп. До таких методів відносяться навантажувальні тести.

Розглянемо спочатку найбільш розповсюджені методи вивчення гуморального імунітету, засновані на серологічних імунних реакціях.

14.1. Серологічні імунні реакції

В процесі розвитку імунної відповіді вмикаються різні реакції клітинного та гуморального імунітету, але дуже значне навантаження по знешкодженню антигенів беруть на себе антитіла. В залежності від природи антигена імуноглобуліни можуть спричиняти різні ефекти, а саме здійснювати такі реакції:

· Аглютинація – зклеювання корпускулярних антигенів з утворенням осідаючих агрегатів;

· Преципітація – зв’язування розчинних антигенів з утворенням преципітата, що складається з дрібнодисперсних, деякий час не осідаючих агрегатів;

· Нейтралізація біологічної активності збудників та їх токсинів;

· Опсоно-фагоцитарна реакція – активне приваблення фагоцитів комплексом “антиген – антитіло” за рахунок зв’язування рецепторів фагоцитів з Fc-фрагментом антитіла (опсонізація), що веде до активізації поглинання і перетравлення антигена;

· Реакція лізиса, що базується на здібності антитіл здійснювати руйнування (лізис) клітин деяких збудників і чужерідних клітин крові (відповідно реакції бактеріоліза і гемоліза);

· Реакція зв’язування комплемента (за класичним шляхом) – відбувається за участю антитіл за рахунок приєднання компонентів комплемента до комплекса “антиген – антитіло”, що прискорює елімінацію антигена шляхом фагоцитування або лізиса.

Перелічені реакції відбувається в умовах “in vivo”, тобто в організмі людини і ссавців, але можуть застосовуватись і “in vitro” у лабораторній діагностиці інфекційних хвороб та імунопатологій. Основою застосування серологічних імунологічних методів є специфічність утворення пар “антиген – антитіло”, а саме, маючи один з компонентів такого імунного комплекса, можно виявити інший. Так, для виявлення у клінічному матеріалі мікробних антигенів, алергенів або аутоантигенів використовують діагностичні імунні сироватки, і навпроти, для ідентифікації антитіл у сироватках хворого застосовують стандартні антигени (діагностикуми).

14.1.1. Реакція аглютинації

Аглютинація (від лат. agglutinatio – зклеювання) – феномен зклеювання корпускулярних антигенів (мікробних та тваринних клітин, часток латекса та ін.) специфічними антитілами сироватки з утворенням агрегата – аглютината, який випадає в осад. Аглютинат можна побачити неозброєним оком. Здатність зклеювати, тобто аглютинувати корпускулярні антигени проявляють в основному IgM та IgG. В цій реакції антигени позначають як аглютиногени, а антитіла - як аглютинини. При неспецифічному осадженні корпускулярних антигенів утворюється щільний осад (пуговка), який при взбовтуванні дає рівномірне помутніння. Специфічний аглютинат – крихкий, у вигляді сітки, при взбовтуванні рідина залишається прозорою, а в ній виявляються хлоп’я.

Для діагностики інфекційних хвороб реакція аглютинації застосовується у двох напрямках: 1) для виявлення специфічних антитіл у сироватках хворих за допомогою стандартних мікробних діагностикумів; 2) для ідентифікації збудника хвороби за допомогою діагностичних сироваток.

Реакція аглютинації “in vitro” потребує обов’язкового додавання електроліта (наприклад, фізіологічного розчина), тобто в ній приймають участь 3 компоненти: антиген, антитіло, електроліт. В реакції можна виділити дві стадії: на першій відбувається зв’язування антигенної детермінанти антигена з активним центром антитіла, тобто, з’єднання епітопа з паратопом; на другій – утворення аглютината у присутності електроліта, який знижує електричний заряд комплексів “антиген – антитіло” і прискорює їх зклеювання з утворенням аглютината.

Реакцію аглютинації ставлять у пробірках, на скляних чи картонних пластинках або у лунках полістеролових пластин. Для первинної ідентифікації збудника спочатку застосовують прискорений метод – пробну аглютинацію на склі з використанням високих концентрацій антигенів і антитіл. Така якісна реакція за декілька хвилин дозволяє встановити приналежність збудника до певного виду чи роду. Далі ставиться кількісна реакція у пробірках – розгорнута аглютинація – з різними розведеннями сироватки і однаковою концентрацією антигена, яка дозволяє визначити титр аглютинуючих антитіл – ту найменшу кількість антитіл, що здатна утворити аглютинат.

Розгорнута реакція аглютинації ставиться у такий спосіб: завчасно роблять ряд десятикратних роведень сироватки, використовуючи фізіологічний розчин (0,85% NaCl), потім у пробірки вносять по 0,5 мл сироватки у зростаючих розведеннях і по 0,5 мл стандартного діагностикума або суспензії досліджуваної культури з концентрацією клітин 1 млрд на 1 мл. Проводять інкубацію суміші при 37⁰С. Обов’язково ставлять контроль сироватки і антигена для запобігання отримання ложнопозитивних результатів із-за спонтанної аглютинації антигена або сироватки. Результат реакції аналізують спочатку через 2 год. і додатково через 20-24 год.. Оцінювання ведуть за чотирьоххрестною системою. При урахуванні результатів реакції визначають специфічність взаємодії антигена і антитіла, титр сироватки, характер аглютината. Останній залежить від природи антигена. Крупнохлопчастий осад дають джгутикові Н-антигени бактерій досить швидко, за 1-2 год. (Н-аглютинація); дрібнозернистий аглютинат утворюється повільно (20-24 год.) при взаємодії антитіл з соматичними О-антигенами бактерій (О-аглютинація); капсульні К-антигени дають тяжистий аглютинат (К-аглютинація). Аглютинацію еритроцитів регіструють по утворенню характерного зсідання клітин у вигляді зонтика. При відсутності аглютинації еритроцити осідають у вигляді пуговки. Надосадкова рідина при формуванні чіткого аглютината повинна бути прозорою.

Слід відмітити, що змінення титрів антитіл у сироватках хворого в динаміці інфекційного процесу може вказувати на ту чи іншу фазу розвитку інфекції і має діагностичне значення. Коли аглютинацію застосовують для серологічної ідентифікації збудника, реакція оцінюється як позитивна при розведенні діагностичної сироватки не менш половини її титра.

На практиці використовують декілька варіантів аглютинації: реакції прямої і непрямої аглютинації, реакцію гальмування гемаглютинації та ін..

Пряма аглютигація проводиться для безпосереднього виявлення корпускулярних мікробних антигенів або антигенів еритроцитів, що визначають їх приналежність до груп крові, або для виявлення відповідних антитіл у сироватках. Типовим прикладом прямої реакції аглютинації є реакція Відаля, яка дозволяє проводити дифереціальну діагностику кишкових інфекцій, а саме у досліджуваних сироватках за допомогою діагностикумів виявляються антитіла до одного зі збудників: Salmonella typhi, S. paratyphi A або S. paratyphi B. У перші дні хвороби, коли антитіла у сироватці ще не з’явились, можна виявити цих збудників при висіві із випражнень хворого і наступної їх ідентифікації за допомогою діагностичних специфічних сироваток.

Пряма аглютинація застосовується для серологічної видової ідентифікації сальмонел, шигел, ешеріхій та ін. бактерій. Для цього використовують полівалентні та моновалентні сироватки (поліспецифічні та моноспецифічні). Звичайно спочатку проводиться аглютинація з полівалентними сироватками, які містять декілька видів антитіл специфічних до антигенів даного роду чи виду бактерій. Потім ставиться розгорнута аглютинація у пробірках з моновалентними сироватками, яка дозволяє визначити не тільки вид, а й серотип (синонім “серовар” – серологічний варіант) збудника.

Адсорбція антитіл за методом Кастелані. Реакція прямої аглютинації використовується також для очистки неадсорбованих полівалентних сироваток і отримання на їх основі адсорбованих моновалентних (моноспецифічних, монорецепторних), бівалентних та ін.. Таку очистку здійснюють шляхом послідовного додавання антигенів для зв’язування і виведення в осад “непотрібних” антитіл.

Непряма аглютинація (пасивна аглютинація)– модифікація прямої аглютинації, яка дозволяє виявляти некорпускулярні розчинні антигени, адсорбовані на корпускулярних носіях. Як носії для таких антигенів застосовують імунологічно інертні частки латекса, бентоніта, оксид барія, еритроцити людини або ссавців, клітини стафілококів (реакція коаглютинації) тощо. Але найбільше розповсюдження набули реакції з використанням еритроцитів. Для покращення сорбції еритроцити обробляють таніном, формаліном або бензидином. Еритроцити з адсорбованими на них антигенами називають сенсибілізованими, а реакція, в якій вони беруть участь, має назву реакції непрямої або пасивної гемаглютинації(РНГАабоРПГА). Сама назва реакції підкреслює, що еритроцити виконують в ній лише пасивну роль.

РНГА ставиться у лунках спеціальних полістиролових пластинок (планшеток) таким чином: прямо у лунках роблять двократні розведення сироваток і до них додають еритроцитарний діагностикум. Після 2 год. інкубації при 37⁰С оцінюють результат. Якщо антиген на поверхні еритроцита зв’язується із специфічними антитілами сироватки, то еритроцити випадають в осад з утворенням перегорнутого “зонтика”, тобто рівномірно покриваючи дно лунки (позитивна реакція). У протилежному випадку еритроцити зсідаються у центрі лунки, утворюючи так звану “пуговку” (негативна реакція).

Так само, як і пряма аглютинація, РНГА використовується у двох напрямках – для виявлення антитіл і антигенів. Для виявлення у сироватках хворих специфічних антитіл за допомогою РНГА використовують спеціальні еритроцитарні діагностикуми – сенсибілізовані певним антигеном еритроцити. У протилежному напрямку – для виявлення розчинних антигенів – використовують антитільні еритроцитарні діагностикуми –препарати еритроцитів з адсорбованими на них антитілами.

РНГА застосовують для серодіагностики черевного тифу (за допомогою Vi-еритроцитарного діагностикума), дизентерії, чуми, стафілокока (виявлення ентеротоксинів), токсоплазмоза, а також аутоантитіл.

Реакція непрямої аглютинації є більш чутливою у порівнянні з прямою і дозволяє виявляти антигени та антитіла у мінімальній кількості.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА) використовується для встановлення видової та типової належності вірусів, зокрема вірусів грипу. В основу реакції покладена здатність вірусів адсорбуватися на еритроцитах і викликати їх неспецифічну аглютинацію. Гемаглютинуюча активність вірусів може бути пригнічена специфічними антитілами, які нейтралізують віруси. Для виявлення серотипу віруса, виділеного від хворого, використовують специфічні діагностичні протигрипозні сироватки А1, А2 і В. Реакція здійснюється у лунках плексиглазових пластинок. У лунки вносять проби сироваток по 0,25 мл у наростаючих розведеннях і потім додають по 0,25 мл рідини, що містить віруси у робочому розведенні. Робоче розведення досліджуваного віруса визначається передчасно в реакції гемаглютинації. Суміш у лунках взбовтують та інкубують при кімнатній температурі протягом 1-2 год., після чого у всі лунки додають по 0,5 мл суспезії еритроцитів півня. Через 1-2 год аналізують результати реакції. В тих рядах, де діагностичні сироватки не специфічні до віруса, буде спостерігатися гемаглютинація у вигляді зонтиків. І навпроти, якщо антитіла діагностичної сироватки будуть зв’язувати і нейтралізувати віруси, гемаглютинація буде пригнічуватись і еритроцити будуть зсідатися у вигляді пуговок. Типова приналежність віруса грипа визначається по тій специфічній сироватці, яка виявила пригнічення гемаглютинації у найвищих титрах.

Латекс-аглютинація (ЛАГ)– один з варіантів непрямої аглютинації, яка використовується як експрес-метод для швидкого виявлення антигенів мікроорганізмів у клінічному матеріалі. У даній реакції як носій антигенів використовуються частки латекса з різним діаметром. Реакцію виконують на склі мікрометодом: до 50 мкл досліджуваного матеріала додають 10 мкл латекс-препарата, сенсибілізованого антитілами. У комерційні латекс-препарати входять три стандартних зразка (контрольні тести): зразок з позитивною реакцією, зразок з негативною реакцією та зразок несенсибілізованого латекса з антигенним матеріалом.

Реакція коаглютинації – є різновидом пасивної аглютинації. В ній як носій використовують клітини золотистого стафілокока, чий поверхневий А-білок може зв’язуватись з Fс-фрагментами IgM та IgG. Реакцію проводять на склі у такий спосіб: до краплини 2% суспензії сенсибілізованих антитілами стафілококів додають суспензію досліджуваних бактерій. При відповідності антигена антитілам (адсорбованих на стафілококах), через 30-60 сек. Відбувається чітка аглютинація.

Реакція агрегат-гемаглютинації (РАГА) дозволяє за допомогою еритроцитарних діагностикумів виявляти не тільки антигени, а й циркулюючі імунні комплекси (ЦИК) - комплекси “антиген – антитіло”. При додаванні до сенсибілізованих еритроцитів сироватки хворого, яка містить антигени і антитіла до них, відбувається гемаглютинація із залучанням імунних комплексів.

Проба Кумбса – різновид реакції аглютинації для виявлення неповних блокуючих антитіл – Ig з одним активним центром. Може виконуватись як пряма, так і як пасивна аглютинація. Неповні антитіла з’єднуються з антигеном, але не здатні утворювати з ним великі агрегати, із-за чого реакція не візуалізується. Тому для виявлення специфічного зв’язування антигена з антитілом використовують антиглобулінову сироватку, яка містить імуноглобуліни проти неповних антитіл. Реакцію здійснюють у 2 етапи: 1) інкубують досліджувану сироватку (неповні антитіла) з відповідним діагностикумом – антигеном, реакція не візуалізується; 2) до інкубаційної суміші додають антиглобулінову сироватку, антитіла якої зв’язуються з Fc-фрагментами неповних антитіл, вже утворивших комплекси з антигеном. При специфічній відповідності неповних антитіл антигенам (позитивна реакція) на другому етапі виявляється аглютинація.

Пробу Кумбса використовують у діагностиці бруцельоза, аутоімунних та алергічних захворюваннях, при аналізі груп крові.

Імуномагнітне виявлення антигенів – прискорений метод непрямої реакції аглютинації на склі. У даному випадку антитіла зшивають з полімерними супермагнітними частками. Кожна з таких часток може зв’язати 10⁷ - 10⁸ клітин мікроорганізмів, завдяки чому швидко відбувається аглютинація з утворенням чіткого аглютината.

Реакція преципітації та її варіанти

Преципітація – це також реакція осадження антигенів під впливом антитіл імунної сироватки, але на відміну від аглютинації у даному випадку характерний дрібнодисперсний осад – преципітат – утворюють не корпускулярні, а розчинні антигени. В реакції преципітації антигени – це преципітиногени, а антитіла – преципітини. Реакція преципітації принципово мало відрізняється від аглютинації, вона теж проходить у дві фази у присутності електроліта (розчина солей).

В якості преципітиногенів можуть виступати екстракти і продукти розпаду мікроорганізмів, тканин, органів, різні білки, інші хімічні речовини, повні і неповні розчинні антигени. Методика постановки реакції преципітації також відрізняється від аглютинації, а саме, зазвичай розводять не сироватку, а антиген у зв’язку з високою його концентрацією на одиницю об’єму. Найбільша кількість преципітата утворюється при оптимальному (еквівалентному) співвідношенні компонентів реакції, або при незначному надлишку антигена. При великому надлишку антигена або антитіл преципітат не формується. На швидкість утворення преципітата впливають різні фактори: температура, рН, концентрація солей, спосіб додавання антигена. Реакція преципітації більш чутлива і специфічна, ніж аглютинація, і як правило, не дає перехресного реагування антитіл із спорідненими груповими антигенами. А якщо такий феномен виникає, то потрібно більше розвести преципітуючу сироватку, тоді позитивний результат буде виявлятися тільки з найбільш специфічним антигеном.

Реакція преципітації досить розповсюджена у лабораторній практиці при діагностиці сибірки, чуми, туляремії, інших захворювань, а також у судово-медичній експертизі для визначення видової приналежності білка, плям крові, сперми і т.п. В санітарній мікробіології преципітацію застосовують для визначення домішок у молоці, для виявлення фальсифікації м’ясних та рибних виробів. Може використовуватись реакція преципітації і при визначенні ступеню спорідненості живих істот за складом їх білків.

Існує декілька варіантів реакції преципітації: реакція флокуляції, кільцепреципітація, імунодифузія (преципітація в гелі), імуноелектрофорез (поєднання імунодифузії з електрофорезом). Преципітацію можна проводити у рідкому (флокуляція та кільцепреципітація) та щільному (преципітація в гелі) середовищах.

Реакція флокуляції є різновидом преципітації у рідкому середовищі. Використовується для виміру сили токсинів і анатоксинів бактерій, зокрема дифтерійного анатоксина. Для визначення специфічності взаємодії антигена і антитіла змішують у пробірках однакові об’єми цільної (або розведеної у 2 рази сироватки) і розведеного фізіологічним розчином антигена. В процесі інкубації при 45⁰С спостерігають, в якій пробірці раніше утворилися ніжні хлоп’я (ініціальна флокуляція). Кількість антитоксичних одиниць сироватки у пробірці з ініціальною флокуляцією відповідає кількості одиниць анатоксина. Реакцію можна ураховувати точніше за допомогою вимірювання мутності реакційної суміші на фотоелектроколориметрі.

Кільцепреципітація– якісна реакція преципітації. Проводиться у спеціальних тонких преципітаційних пробірках, куда спочатку наливають нерозведену преципітуючу сироватку, а зверху на неї нашаровують розчин антигена у зростаючих розведеннях, не допускаючи змішування двох шарів. При позитивній реакції через декілька хвилин на межі розділу шарів сироватки і антигена спочатку з’являється слабка опалесценція, а потім чітке кільце білуватого кольору – преципітат. На відміну від аглютинації титр преципітуючої сироватки визначається по титру антигена, тобто по тій найменшій кількості антигена, яка ще дає преципітат. Реакція кільцепреципітації дуже чутлива і специфічна і дозволяє виявляти антигени, розведені у тисячі і навіть мільйони разів. Кільцепреципітація використовується для визначення збудників хвороб по наявності певних антигенів, а також для визначення видової приналежності крові тварин за допомогою людських, курячих та інших сироваток.

Реакція термопреципітації Асколі– різновид реакції кільцепреципітації. Вона основана на тому, що преципітиногени проявляють значну стійкість до високої температури, витримують довготривале кип’ятіння, зберігаючи при цьому здатність реагувати з антитілами. Реакція термопреципітації Асколі використовується в основному для діагностики сибірської виразки (сибірки).

Реакції преципітації в гелі проводяться на щільних середовищах – на 1% агарі чи агарозі у чашках Петрі або на скляних пластинках. Вперше цей метод запропонував Дж. Оудін ще у 1946 р., встановивши, що антитіла сироваток можуть здійснювати дифузію в гелі та зв’язуватись прямо в ньому з антигенами. Іншими вченими були запропоновані модифікації методу преципітації в гелі. Деякі з них ми розглянемо нижче.

Зустрічна двомірна дифузія (метод Оухтерлоні)дозволяє аналізувати не одну пару “антиген – антитіло”, а складні суміші мікробних антигенів і різних білків сироватки. На чашках Петрі з агаром роблять невеличкі (діаметром 5-6 мм) лунки: одна – в центрі, інші – по периметру, на відстані 1-2 см від центральної. В центральну лунку вносять антиген, а в інші – різні сироватки (або навпаки). Антигени і антитіла здійснюють дифузію у гель і починають рухатись назустріч один одному. Через 1-3 доби інкубації при кімнатній температурі в місцях, де зустрічаються специфічні антиген і антитіло, в гелі утворюються білуваті дугоподібні смужки – лінії преципітації. Якщо лінії преципітації з’являються біля декількох лунок, то в досліджуваному матеріалі є декілька компонентів, що вступають в реакцію.

Проста радіальна імунодифузія(метод Манчині) використовується в лабораторній практиці для визначення концентрації імуноглобулінів (IgM, IgG, IgA) у сироватках людей. Радіальна імунодифузія проводиться у гелі на спеціальних скляних або полістиролових пластинах. Постановка реакції передбачає наявність стандартної сироватки з відомою концентрацією імуноглобулінів (для побудування калібровочної кривої), а також моноспецифічних антисироваток проти IgM, IgG, IgA (для виявлення Ig у сироватці хворого). Антисироватку отримують шляхом імунізації тварини людськими імуноглобулінами певного класу (М, G чи А). Далі здійснюють очистку тваринної сироватки до такого стану, коли в ній залишаться антитіла тільки одного виду (наприклад, проти людських IgM).

Для постановки реакції завчасно готують гель на основі освітленого 1% агара (або агарози) з додаванням фізіологічного розчина (електроліта) і мертіолята (консерванта). У розплавлений гель при температурі 48⁰С вносять моноспецифічні антисироватки: в одну пробірку – антисироватку проти IgM, в другу – IgG, в третю – IgA. Кожний варіант геля наносять на окрему спеціальну пластину і підписують її. Після застивання геля в ньому роблять декілька горизонтальних рядів лунок з діаметром 2-3 мм. В них вносять по 20 мкл передчасно розведених проб досліджуваної сироватки хворого і стандартної сироватки. На одній пластині можно одночасно проаналізувати декілька сироваток хворих на наявність Ig певного класу. Пластини утримують у вологій камері при кімнатній температурі 48 годин. Завдяки дифузії в агар навколо лунок з’являються кільця преципітації з різним діаметром в залежності від розведення сироваток. Іноді для покращення візуалізації зон преципітації гелі профарбовують амідо-чорним. Після відмивки барвника преципітати набувають синього кольору. Вимірюють діаметр кілець зразків стандартної сироватки і для кожного виду Ig будують свою калібровочну криву, відкладуючи на осі абсцис концентрацію імуноглобуліна в пробі, а на осі ординат – квадрат діаметра зони преципітації. Вимірявши діаметри преципітатів досліджуваної сироватки на трьох пластинах, можна визначити концентрацію імуноглобулінів трьох класів у даній сироватці.

Імуноелектрофорез – варіант імунопреципітації в гелі, в якому поєднані електрофорез і метод зустрічної дифузії Оухтерлоні. Цей метод дозволяє визначати склад багатокомпонентних сумішей розчинних антигенів (до 30 компонентів). Спочатку на агаровій пластині здійснюють розділення суміші антигенів в електричному полі. Потім у канавку, вирізану в гелі паралельно напрямку електрофоретичного розділення, наливають преципітуючу сироватку. В результаті уздовж канавки утворюються дугоподібні лінії преципітації. Кількість цих ліній відповідає кількості специфічних пар “антиген – антитіло”.

Імуноблотинг – один з варіантів електрофоретичного розділення антигенів у гелі, який супроводжується переносом фракціонованих антигенних білків з гелевої пластинки на лист нітроцелюлози (блотинг), де в подальшому здійснюють ідентифікацію антигенів за допомогою специфічних сироваток.

Електрофорез антигенних білків проводять у гелі з додаванням додецилсульфата натрія, що дозволяє розділяти сотні компонентів суміші, визначати їх розміри, виявляти подібність антигенів. Блотинг використовують у зв’язку з тим, що не всі антитіла здатні проникати у пори геля. При накладанні нітроцелюлозної мембрани на гель отримуюють так званий “сендвіч”. Його занурюють у буферний розчин, витримуюють декілька діб і завдяки градієнтній дифузії антигени з геля переходять у твердофазну пористу нітроцелюлозну мембрану. Таким чином отримують відбиток електрофореграми – блот (блотограму), на якому за допомогою специфічних сироваток ідентифікують певні антигени. Для виявлення комплексів “антиген-антитіло” використовують різні барвники, які здатні зв’язуватись з білками – амідо чорний 10 В, кумасі блакитний R-250, понсо S, швидкий зелений FCF та інші.

Поиск по сайту: