Метод лазерної проточної цитофлуориметрії

Даний метод виник на базі люмінісцентно-серологічного метода завдяки створенню лазерних проточних цитофлюориметрів і почав поширюватись на початку 80-х років ХХ століття у зв’язку зі створенням гибрідомної технології одержання моноклональних антитіл до різних поверхневих антигенів клітин крові, що характерні для певних субпопуляцій. Лазерний проточний цитофлуориметр дозволяє за допомогою комп’ютерної технології ідентифікувати різні субпопуляції імуноцитів з урахуванням інтенсивності флюоресцентного світіння та їх розміру при проходженні у потоці рідини.

Цей метод – один із самих ефективних для клінічних досліджень, він дає стабільно відтворені результати при чіткому дотриманні інструкцій ходу аналіза і використання реактивів фірми-виробника.

За допомогою метода лазерної проточної цитофлюорометрії можна визначати поверхневі антигенні маркери лімфоцитів з використанням мічених моноклональних антитіл як у цільній крові, так і в окремих клітинних суспензіях, виділених з крові. Для здійснення даного методу невелику кількість капілярної крові з пальця (0,05 мл), змішаної з антикоагулянтом, инкубують з міченими флюрохромом моноклональними антитілами при 0⁰С протягом 15-30 хв. Потім проводять гемоліз еритроцитів, витримуючи їх з гемолітичною рідиною (0,83%-ний розчин хлористого амонію з домішкою ЕДТА) при 20°С протягом 40-60 сек. Контроль результатів реакції ведуть за допомогою лазерного проточного цитофлюориметра, ідентифікуючи клітини за розміром (популяції лімфоцитів, моноцитів і гранулоцитів) та за інтенсивністю світіння.

Найбільш широко метод проточної цитофлюорометрії застосовується для визначення рецепторів апоптоза нейтрофілів і лімфоцитів (CD95), що є найважливішим показником імуносупресії. Але можливості проточного цитофлюориметра при використанні широкого набору моноклональних антитіл досить широкі. Він дозволяє здійснівати виявлення внутрішньоклітинних і позаклітинних цитокінів, визначення активності натуральних кілерів, вивчення мобілізації кальцію, утворення активних форм кисню, надавати оцінку поглинальної здатності фагоцитів і їхньої бактерицидної активності, поглинання, переробки і презентації антигенів моноцитами, оцінку проліферативної активності лімфоцитів та ін.. Практичні всі інші імунологічні методи вивчення клітинного імунітету, можна замінити їх модифікаціями на лазерному проточному цитофлуориметрі.

Візуальний стрептавідин-біотиновий метод

Датською компанією DAKO, а потім і багатьма іншими фірмами налагоджений випуск комплекту реагентів для фенотипіювання лімфоцитів за допомогою візуального стрептавідин-біотинового методу (технологія LSAB). Даний метод, не вимагаює складного лабораторного устаткування і має високу чутливість, дає можливість у мазках крові з пальця фарбувати клітини різних субпопуляцій лімфоцитів і спостерігати їх у світловому мікроскопі.

Візуальний стрептавідин-біотиновий метод за своєю специфічностю і чутливістю не поступається методу проточної цитофлуориметрії, але на відміну від останнього відрізняється більшою економічністю, оскільки не потребує дорогого устаткування.

Цей метод принципово відрізняється від люмінісцентно-серологічно тільки тим, що антитіла до антигенних маркерів клітин кон’югуються не з флюорохромом, а з ферментною міткою. В останні 10-15 років цей метод використовується для виявлення різних патологічних структур і клітин у гістоцитохімічних дослідженнях. Висока чутливість метода дозволяє застосовувати його для диференціальної діагностики пухлин, імунофенотипіювання пухлин (особливо лімфоїдних), ідентифікації різних мікроорганізмів у тканинах, визначення гормонів та їхніх рецепторів тощо.

Широке розповсюдження цього методу пов’язане з тим, що готові тест-системи для цього методу були розроблені багатьма відомими фірмами.

Поиск по сайту: