10. Подтверждение принадлежности, выделенной культуры микобактерий к комплексу М. tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов, является обязательным. 11. Первичная идентификация микобактерий комплекса М. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам: скорость роста на плотных питательных средах; пигментообразование; морфология колоний; наличие кислотоустойчивости; температура роста. Для дифференциации микобактерий комплекса М. tuberculosis, к которому относятся следующие виды микобактерий: М. tuberculosis, М. bovis, M. africanum, M. Microti, от медленнорастущих нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий применяются следующие основные биохимические тесты: тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест); тест на наличие нитратредуктазной активности; тест на наличие термостабильной каталазы; тест на наличие роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл) (или рост на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия). 12. Для дифференциации М. tuberculosis и М. bovis учитываются результаты следующих проб: ниациновый тест; тест на наличие нитратредуктазы; тест на наличие пиразинамидазы; определение видовой принадлежности молекулярно-генетическим исследованием (Geno Type MTB® DR). 13. Для определения лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда применяют метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена (далее – Л-Й). 14. Устойчивость тестируемых штаммов определяется отношением числа колоний, выросших на среде с лекарствами к числу колоний, выросших на среде без лекарств. Этот показатель позволяет узнать процент устойчивых мутантов в общей популяции жизнеспособных колониеобразующих единиц. 15. Критические концентрации лекарственных препаратов в среде Л-Й: Изониазид - 0,2 мкг/мл; Стрептомицин - 4,0 мкг/мл; Рифампицин - 40 мкг/мл; Этамбутол - 2,0 мкг/мл; Офлоксацин - 2 мкг/мл; Амикацин - 20 мкг/мл; Капреомицин - 20мкг/мл; Этионамид - 20 мкг/мл; Циклосерин - 20 мкг/мл; ПАСК - 1,0 мкг/мл; Канамицин - 20 мкг/мл. 16. При приготовлении среды с препаратами учитывается активность препарата, которая может варьировать от одной партии/серии лекарств к другой, в зависимости от его производителя. Эти сведения приводятся на этикетках контейнеров, упаковках или предоставляются производителем. 17. Пробирки в термостате хранят в наклонном положении с неплотно прикрытыми крышками при температуре 370 оC, до появления видимого роста на среде без лекарств, затем в течение 4-6 недель с закупоренными пробками. 18. Интерпретация результатов. Критерием устойчивости является 1,0% роста бактериальной популяции для всех препаратов. Через 4 недели инкубации рост на среде, не содержащей лекарства, инокулированной из суспензии 10-4, сравнивают с ростом на среде с препаратом, инокулированным из суспензии 10-2. Если число колоний больше на среде, содержащей лекарство (равен или превышает 1%), тестируемый штамм считается устойчивым.
Приложение 18 к Инструкции по организации и осуществлению профилактических мероприятий по туберкулезу
Проведение культуральной диагностики туберкулеза на автоматизированной системе BАСТЕС MGIT – 960 с использованием жидких сред в лабораториях ПТО
1. Культуральная диагностика туберкулеза с использованием жидких сред осуществляется на автоматизированной системе BАСТЕС MGIT – 960. В случае роста МБТ (до уровня 105-106 КОЕ на 1 мл среды) прибор оценивает пробу как положительную и подает световой и/или звуковой сигнал. При отсутствии роста в течение шести недель (42 дня) прибор оценивает пробу как отрицательную. 2. Посевы на жидкие среды выполняются в ламинарном боксе II класса защиты. Пробирки перед работой маркируют, обращая внимание на то, чтобы маркировочная запись не попала на штрих-код пробирок. 3. При обнаружении изменений в питательной среде в отрицательных пробирках, готовят мазки для микроскопического исследования и проводят посев материала на кровяной агар (для контроля контаминации) и на среду Л-Й. 4. Для подтверждения положительных результатов из каждой пробирки MGIT готовят мазки, которые окрашивают по Циль-Нильсену в соответствии с общими рекомендациями. Кислотоустойчивые колонии в виде «кос» подтверждают наличие микобактерий туберкулеза. При обнаружении отдельных кислотоустойчивых бактериальных клеток проводится идентификация культуры. 5. Если в пробирке, идентифицируемой аппаратом как «положительная», при микроскопии отмечается отрицательный результат, а сама среда при визуальной оценке прозрачная и нет подозрения на контаминацию, пробирку необходимо поместить обратно в систему на 3 дополнительных дня. После этого повторяют микроскопию мазков. При повторном отрицательном результате микроскопии, отсутствии визуальных признаков роста и контаминации пробы (отрицательный рост на кровяном агаре), а также отсутствии признаков роста на среде Л-Й в течение 10 недель, пробу считают отрицательной. 6. Допустимый уровень контаминации для плотных питательных сред 3-5%, для жидких питательных сред – 7-8%. 7. Для идентификации видов микобактерий используются следующие критерии: 1) интенсивность роста: M.tuberculosis, M. bovis и, в определенной степени, M.kansasii растут медленно по сравнению с нетуберкулезными микобактериями; 2) при росте в жидкой среде МБТ принимают грануловидную форму, большинство нетуберкулезных микобактерий чаще образуют легкую однообразную замутненность среды (кроме M. kansasii); 3) в мазке, сделанном из положительного бульона MGIТ, микобактерии туберкулезного комплекса образуют ярко выраженные сгустки и змеевидные нити (корд-фактор), тогда как нетуберкулезные бактерии образуют разрозненные небольшие сгустки и нити, либо единичные клетки. 8. Постановка ТЛЧ: 1) ТЛЧ к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда на аппарате BАСТЕС MGIT – 960 проводятся на основе метода пропорций. Для ТЛЧ используются более низкие концентрации чистых субстанций ПТП, чем на плотных средах (во избежание ложных результатов чувствительности): стрептомицин – 1,0 мкг/мл; изониазид – 0,1 мкг/мл; рифампицин – 1,0 мкг/мл; этамбутол – 5,0 мкг/мл; 2) засеянные пробирки ставят в специальные держатели для постановки лекарственной чувствительности в строгой последовательности: контроль, стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол. 9. Учет результатов: по завершении теста (14-21 день) на приборе появляется сообщение о готовности результатов. Для их получения сканируют штрих-код держателя и распечатывают отчет, в котором указаны результаты ТЛЧ к каждому лекарственному препарату: чувствительный (S); резистентный (R), результат теста не определен или ошибка (X). Прибор интерпретирует результаты, когда единица роста (GU) в контроле роста достигает значения 400 (в течение 4-13 дней). Показатели единицы роста флакона с лекарственным препаратом оцениваются: S – единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет не менее 100; R – единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет 100 и более; Х – неясные результаты, получаемые при определенных обстоятельствах, которые влияют на процедуру теста (например, при достижении единицей роста контрольного образца величины > 400 менее чем за 4 дня). В таком случае тест необходимо повторить с чистой, активно растущей культурой, которая подтверждена как комплекс M. tuberculosis. Некоторые лекарственно-устойчивые штаммы растут в среде очень медленно, и со стандартным инокулятом результаты могут быть не достигнуты в течение 13 дней. В таком случае необходимо повторить исследование. Отчетность: результаты исследования на лекарственную чувствительность передаются в клинические подразделения сразу по мере их готовности. Результат указывается как «чувствительный» или «резистентный» с названием используемого метода, типа лекарственного препарата и его концентрации. 10. Тесты на чувствительность к пиразинамиду: ТЛЧ к пиразинамиду требует соблюдения особых условий к уровню рН среды (in vitro пиразинамид активен только в кислой среде) и для аппарата BАСТЕС MGIT - 960 разработан тест, в котором рН среды не превышает 6,0; концентрация пиразинамида для компенсации рН увеличена до 100 мкг/ мл; 11. ТЛЧ к препаратам второго ряда. Готовые наборы для ТЛЧ к препаратам второго ряда отсутствуют. Реагенты: проводится расчет критических концентраций субстанции ПТП второго ряда. Препараты, полученные после разведения дистиллированной водой или соответствующим растворителем, с помощью автоматической пипетки добавляют по 0,1мл (100 мкл) в промаркированные пробирки MGIT. Подготовка культуры для ТЛЧ и сам тест проводится аналогично вышеописанным процедурам постановки к ПТП первого ряда. Концентрации ПТП второго ряда: амикацин – 1,0 мкг/мл; капреомицин – 2,5 мкг/мл; офлоксацин – 2,0 мкг/мл; этионамид – 5,0 мкг/мл. При расчете учитывается количество активного вещества в 1 г субстанции: 1) первичное разведение офлоксацина и этионамида проводится диметилсульфоксидом (DMSO). 2) препараты для хранения дозируются объемом не менее 0,5 мл (3-4 ТЛЧ) с учетом потери при хранении.
Приложение 19 к Инструкции по организации и осуществлению профилактических мероприятий по туберкулезу
Проведение молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза и определения лекарственной чувствительности (GenoType ® MTBDR и Xpert MTB/RIF)
1. Устойчивость к рифампицину закодирована в единственном гене rpoB, отвечающим за активность РНК, устойчивость к изониазиду контролируется мутациями сразу в четырех генах – katG, inhA, ahpC и oxyR, используется набор GenoType ® MTBDR plus- тест. 2. Идентификация устойчивости к рифампицину проводится на основании выявления мутаций в гене rpoB (кодирующем бета-субъединицу РНК полимеразы). Идентификация высокого уровня устойчивости к изониазиду проводится на основании выявления мутаций в гене katG (кодирующем выработку каталазы-пероксидазы), тогда как низкий уровень устойчивости к этому препарату выявляется на основании выявления мутаций в регионе промотора гена inhA (кодирующего NADH-Enoyl-АТФ-редуктазу). 3. Набор GenoType ® MTBDR sl-тест позволяет в течение 2-х дней выявлять мутации в генах МБТ, ответственных за устойчивость к аминогликозидам и фторхинолонам, т.е. выявлять у больных наличие ШЛУ ТБ задолго до получения результатов бактериологического анализа.
