Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Основные биохимические тесты идентификации М. tuberculosis



10. Подтверждение принадлежности, выделенной культуры микобактерий к комплексу М. tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов, является обязательным.
11. Первичная идентификация микобактерий комплекса М. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам: скорость роста на плотных питательных средах; пигментообразование; морфология колоний; наличие кислотоустойчивости; температура роста. Для дифференциации микобактерий комплекса М. tuberculosis, к которому относятся следующие виды микобактерий: М. tuberculosis, М. bovis, M. africanum, M. Microti, от медленнорастущих нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий применяются следующие основные биохимические тесты:
тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест);
тест на наличие нитратредуктазной активности;
тест на наличие термостабильной каталазы;
тест на наличие роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл) (или рост на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия).
12. Для дифференциации М. tuberculosis и М. bovis учитываются результаты следующих проб:
ниациновый тест;
тест на наличие нитратредуктазы;
тест на наличие пиразинамидазы;
определение видовой принадлежности молекулярно-генетическим исследованием (Geno Type MTB® DR).
13. Для определения лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда применяют метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена (далее – Л-Й).
14. Устойчивость тестируемых штаммов определяется отношением числа колоний, выросших на среде с лекарствами к числу колоний, выросших на среде без лекарств. Этот показатель позволяет узнать процент устойчивых мутантов в общей популяции жизнеспособных колониеобразующих единиц.
15. Критические концентрации лекарственных препаратов в среде Л-Й:
Изониазид - 0,2 мкг/мл; Стрептомицин - 4,0 мкг/мл; Рифампицин - 40 мкг/мл; Этамбутол - 2,0 мкг/мл; Офлоксацин - 2 мкг/мл; Амикацин - 20 мкг/мл; Капреомицин - 20мкг/мл; Этионамид - 20 мкг/мл; Циклосерин - 20 мкг/мл; ПАСК - 1,0 мкг/мл; Канамицин - 20 мкг/мл.
16. При приготовлении среды с препаратами учитывается активность препарата, которая может варьировать от одной партии/серии лекарств к другой, в зависимости от его производителя. Эти сведения приводятся на этикетках контейнеров, упаковках или предоставляются производителем.
17. Пробирки в термостате хранят в наклонном положении с неплотно прикрытыми крышками при температуре 370 оC, до появления видимого роста на среде без лекарств, затем в течение 4-6 недель с закупоренными пробками.
18. Интерпретация результатов. Критерием устойчивости является 1,0% роста бактериальной популяции для всех препаратов. Через 4 недели инкубации рост на среде, не содержащей лекарства, инокулированной из суспензии 10-4, сравнивают с ростом на среде с препаратом, инокулированным из суспензии 10-2. Если число колоний больше на среде, содержащей лекарство (равен или превышает 1%), тестируемый штамм считается устойчивым.

Приложение 18
к Инструкции по организации
и осуществлению профилактических
мероприятий по туберкулезу

Проведение культуральной диагностики туберкулеза на
автоматизированной системе BАСТЕС MGIT – 960 с использованием
жидких сред в лабораториях ПТО

1. Культуральная диагностика туберкулеза с использованием жидких сред осуществляется на автоматизированной системе BАСТЕС MGIT – 960. В случае роста МБТ (до уровня 105-106 КОЕ на 1 мл среды) прибор оценивает пробу как положительную и подает световой и/или звуковой сигнал. При отсутствии роста в течение шести недель (42 дня) прибор оценивает пробу как отрицательную.
2. Посевы на жидкие среды выполняются в ламинарном боксе II класса защиты. Пробирки перед работой маркируют, обращая внимание на то, чтобы маркировочная запись не попала на штрих-код пробирок.
3. При обнаружении изменений в питательной среде в отрицательных пробирках, готовят мазки для микроскопического исследования и проводят посев материала на кровяной агар (для контроля контаминации) и на среду Л-Й.
4. Для подтверждения положительных результатов из каждой пробирки MGIT готовят мазки, которые окрашивают по Циль-Нильсену в соответствии с общими рекомендациями. Кислотоустойчивые колонии в виде «кос» подтверждают наличие микобактерий туберкулеза. При обнаружении отдельных кислотоустойчивых бактериальных клеток проводится идентификация культуры.
5. Если в пробирке, идентифицируемой аппаратом как «положительная», при микроскопии отмечается отрицательный результат, а сама среда при визуальной оценке прозрачная и нет подозрения на контаминацию, пробирку необходимо поместить обратно в систему на 3 дополнительных дня. После этого повторяют микроскопию мазков. При повторном отрицательном результате микроскопии, отсутствии визуальных признаков роста и контаминации пробы (отрицательный рост на кровяном агаре), а также отсутствии признаков роста на среде Л-Й в течение 10 недель, пробу считают отрицательной.
6. Допустимый уровень контаминации для плотных питательных сред 3-5%, для жидких питательных сред – 7-8%.
7. Для идентификации видов микобактерий используются следующие критерии:
1) интенсивность роста: M.tuberculosis, M. bovis и, в определенной степени, M.kansasii растут медленно по сравнению с нетуберкулезными микобактериями;
2) при росте в жидкой среде МБТ принимают грануловидную форму, большинство нетуберкулезных микобактерий чаще образуют легкую однообразную замутненность среды (кроме M. kansasii);
3) в мазке, сделанном из положительного бульона MGIТ, микобактерии туберкулезного комплекса образуют ярко выраженные сгустки и змеевидные нити (корд-фактор), тогда как нетуберкулезные бактерии образуют разрозненные небольшие сгустки и нити, либо единичные клетки.
8. Постановка ТЛЧ:
1) ТЛЧ к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда на аппарате BАСТЕС MGIT – 960 проводятся на основе метода пропорций. Для ТЛЧ используются более низкие концентрации чистых субстанций ПТП, чем на плотных средах (во избежание ложных результатов чувствительности): стрептомицин – 1,0 мкг/мл; изониазид – 0,1 мкг/мл; рифампицин – 1,0 мкг/мл; этамбутол – 5,0 мкг/мл;
2) засеянные пробирки ставят в специальные держатели для постановки лекарственной чувствительности в строгой последовательности: контроль, стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол.
9. Учет результатов: по завершении теста (14-21 день) на приборе появляется сообщение о готовности результатов. Для их получения сканируют штрих-код держателя и распечатывают отчет, в котором указаны результаты ТЛЧ к каждому лекарственному препарату: чувствительный (S); резистентный (R), результат теста не определен или ошибка (X).
Прибор интерпретирует результаты, когда единица роста (GU) в контроле роста достигает значения 400 (в течение 4-13 дней). Показатели единицы роста флакона с лекарственным препаратом оцениваются:
S – единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет не менее 100;
R – единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет 100 и более;
Х – неясные результаты, получаемые при определенных обстоятельствах, которые влияют на процедуру теста (например, при достижении единицей роста контрольного образца величины > 400 менее чем за 4 дня). В таком случае тест необходимо повторить с чистой, активно растущей культурой, которая подтверждена как комплекс M. tuberculosis.
Некоторые лекарственно-устойчивые штаммы растут в среде очень медленно, и со стандартным инокулятом результаты могут быть не достигнуты в течение 13 дней. В таком случае необходимо повторить исследование.
Отчетность: результаты исследования на лекарственную чувствительность передаются в клинические подразделения сразу по мере их готовности. Результат указывается как «чувствительный» или «резистентный» с названием используемого метода, типа лекарственного препарата и его концентрации.
10. Тесты на чувствительность к пиразинамиду:
ТЛЧ к пиразинамиду требует соблюдения особых условий к уровню рН среды (in vitro пиразинамид активен только в кислой среде) и для аппарата BАСТЕС MGIT - 960 разработан тест, в котором рН среды не превышает 6,0; концентрация пиразинамида для компенсации рН увеличена до 100 мкг/ мл;
11. ТЛЧ к препаратам второго ряда.
Готовые наборы для ТЛЧ к препаратам второго ряда отсутствуют.
Реагенты: проводится расчет критических концентраций субстанции ПТП второго ряда. Препараты, полученные после разведения дистиллированной водой или соответствующим растворителем, с помощью автоматической пипетки добавляют по 0,1мл (100 мкл) в промаркированные пробирки MGIT. Подготовка культуры для ТЛЧ и сам тест проводится аналогично вышеописанным процедурам постановки к ПТП первого ряда.
Концентрации ПТП второго ряда: амикацин – 1,0 мкг/мл; капреомицин – 2,5 мкг/мл; офлоксацин – 2,0 мкг/мл; этионамид – 5,0 мкг/мл.
При расчете учитывается количество активного вещества в 1 г субстанции:
1) первичное разведение офлоксацина и этионамида проводится диметилсульфоксидом (DMSO).
2) препараты для хранения дозируются объемом не менее 0,5 мл (3-4 ТЛЧ) с учетом потери при хранении.

Приложение 19
к Инструкции по организации
и осуществлению профилактических
мероприятий по туберкулезу

Проведение молекулярно-генетических методов диагностики
туберкулеза и определения лекарственной чувствительности
(GenoType ® MTBDR и Xpert MTB/RIF)

1. Устойчивость к рифампицину закодирована в единственном гене rpoB, отвечающим за активность РНК, устойчивость к изониазиду контролируется мутациями сразу в четырех генах – katG, inhA, ahpC и oxyR, используется набор GenoType ® MTBDR plus- тест.
2. Идентификация устойчивости к рифампицину проводится на основании выявления мутаций в гене rpoB (кодирующем бета-субъединицу РНК полимеразы). Идентификация высокого уровня устойчивости к изониазиду проводится на основании выявления мутаций в гене katG (кодирующем выработку каталазы-пероксидазы), тогда как низкий уровень устойчивости к этому препарату выявляется на основании выявления мутаций в регионе промотора гена inhA (кодирующего NADH-Enoyl-АТФ-редуктазу).
3. Набор GenoType ® MTBDR sl-тест позволяет в течение 2-х дней выявлять мутации в генах МБТ, ответственных за устойчивость к аминогликозидам и фторхинолонам, т.е. выявлять у больных наличие ШЛУ ТБ задолго до получения результатов бактериологического анализа.




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.