Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Клеточный цикл и цикл роста



После посева клеток во флакон они входят в лаг-период продолжительностью 2-24 ч, сменяющийся периодом экспоненциального роста (логарифмическая фаза). В конце этого периода клетки достигают полного монослоя и входят в период замедленного роста или покоя (стационарная фаза), за которым следует фаза снижения количества и гибели клеток (рисунок 8).

Рис. 9. Фазы роста культуры животных клеток:

I – лаг-фаза, II – фаза логарифмического роста, III – стационарная фаза, IV – фаза снижения количества клеток и их гибели.

Эти фазы характерны для всех клеточных линий и позволяют получить воспроизводимые характеристики: продолжительность лаг-периода, время удвоения популяции и насыщающую плотность клеток в монослое на фазе плато. Воспроизводимость данных характеристик возможна только при постоянстве условий культивирования.

Два наиболее очевидных события в растущих клетках – это деление клетки и синтез ДНК. Эти события могут служить маркерами, характеризующими клеточный цикл. Когда митоз начинается, клетка принимает форму шара и готовится к делению. На стадии метафазы клетки слабо прикреплены к субстрату, и их легко отделить встряхиванием или мягкой трипсинизацией. Это явление лежит в основе метода синхронизации путем отбора митотических клеток.

Растущие клетки регулярно делятся примерно один раз в каждые 24 часа. При отсутствии каких-либо ограничений клетки равномерно распределены по клеточному циклу, и если количество клеток удваивается через правильные промежутки времени, то говорят, что культура находится на стадии экспоненциального роста.

Обычно после короткого периода экспоненциального роста тот или иной фактор становится лимитирующим. Это может происходить в результате истощения какого-либо фактора среды или в результате того, что культивируемые клетки полностью покроют поверхность, на которой растут. Скорость роста замедляется, и количество клеток в культуре достигает насыщения (конечная плотность клеток). Когда дальнейшие деления клеток прекращаются, наступает стационарная фаза роста культуры. При восстановлении в культуре лимитирующего фактора клетки возвращаются в фазу G1 клеточного цикла, происходит цикл синтеза ДНК, после чего клетка делится, Все теории, объясняющие такой тип контроля роста, исходят из предположения, что контроль осуществляется на каком-то этапе, расположенном вскоре после деления. После прохождения этого этапа клетки включаются в клеточный цикл и делятся.

Большая часть клеток животных находится под такой формой контроля роста, что они прекращают продвижение по клеточному циклу вскоре после митоза. Следовательно, для стимуляции первичной клеточной культуры, прежде чем клетки возобновят движение по циклу к фазе деления, следует устранить ограничение роста. Клетки некоторых быстро растущих опухолей утрачивают чувствительность к контролю роста и полученные из опухолей первичные клетки легко адаптируются к росту в культуре и могут дорастать до более высокой плотности по сравнению с клетками из нормальных тканей.

В суспензии, однако, клетки могут поддерживать экспоненциальный рост в течение долгого периода и теоретически бесконечно, если их культивировать в хемостате, где увеличение поступления питательных веществ балансируется увеличением оттока клеточной суспензии. Это приводит к постоянству окружающих условий и числа клеток. На практике, однако, этого трудно достигнуть из-за возможности бактериального заражения. Клетки в суспензии растут обычно в непроточных культурах, которые характеризуются примерно такой же кинетикой роста, как и клетки в монослое.

В культурах иногда образуются гигантские клетки – особенно в случаях роста в неоптимальных условиях, когда растущие клетки теряют способность делиться и могут увеличиваться в размере, пока не достигнут в диаметре 1 мм и более. Если число гигантских клеток в культуре растет, это указывает на плохие условия культивирования.

 

Синхронизация клеток

При необходимости получить популяцию клеток, находящихся в одной и той же фазе клеточного роста, используются два различных принципа:

А) Можно блокировать клетки таким образом, чтобы они накапливались на специфической стадии цикла. Блокировка может быть химической или физиологической, но оба эти метода имеют тот недостаток, что клетки подвергаются неблагоприятному воздействию и в результате становятся по некоторым параметрам аномальными.

Б) Можно отобрать клетки, находящиеся на определенной стадии клеточного цикла. Отбор может происходить на основании тех или иных физических свойств, например, слабого прикрепления митотических клеток к субстрату или различного содержания ДНК в клетках, находящихся на разных стадиях клеточного цикла. С другой стороны, отбор можно производить на основе химических свойств, вызывая избирательную гибель остающихся клеток.

Выбор метода зависит от целей эксперимента. В ряде случаев бывает целесообразно проводить начальную стадию эксперимента на не синхронизированной экспоненциально растущей культуре, и затем отбирать клетки на определенной фазе клеточного цикла.

Клетки, растущие в монослое, при делении принимают форму шара. Поэтому во время митоза они оказываются менее прочно прикрепленными к субстрату и могут быть легко отделены от него. При работе этим методом используются экспоненциально растущие клетки, и важно на протяжении всей процедуры поддерживать постоянное значение рН и температуры.

В основе метода избирательной гибели клеток лежит гибель клеток в определенной фазе клеточного цикла, что приводит к избирательному отбору клеток, находящихся вне фазы-мишени. При экспоненциальном росте клеток и прохождении клеток по клеточному циклу увеличение периода экспозиции приводит к снижению количества выживающих клеток и ширины диапазона клеточного цикла, в котором оказываются выживающие клетки.

 




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.