Получение протопластов у грибов

Первой в данной области явилась работа J. Giaja, который показал, что пищеварительный сок виноградной улитки способен растворять клеточные стенки дрожжей. Анализ химического состава выявил наличие целого комплекса ферментов: глюканазы, маннаназы, протеазы, липаза, хитиназа, полигалактуроназа и др. Первые дрожжевые протопласты под действием улиточного сока были получены Эдди и Вильямсоном в 1957 году.

При воздействии на клеточную стенку литических ферментов образуется пора, через которую затем протоплазма выходит в окружающую среду и в присутствии стабилизатора осмотического давления благодаря поверхностному натяжению мембраны приобретает сферическую форму - образуется протопласт. У дрожжевых клеток пора обычно образуется на одном из полюсов клетки или в экваториальной зоне.

Большинство исследователей считает, что основную роль при лизисе грибных клеточных стенок играют глюканазы. В этом явлении нет ничего необычного, так как именно глюканы являются одними из главных компонентов клеточных стенок дрожжей. Однако для быстрого и эффективного лизиса сложной в плане химического состава и структуры грибной стенки необходимо также присутствие в литическом комплексе и других ферментов. При совместном воздействии нескольких ферментов проявляется синергический эффект.

Для получения грибных протопластов широко и успешно применяется литический комплекс Streptomyces spp. и некоторые другие. Для лизиса клеточных стенок при помощи ферментов микробного происхождения применяют или культуральную жидкость после инкубирования микроорганизма, или энзимный препарат, полученный осаждением комплекса ферментов сульфатом аммония или ацетоном. Перед употреблением в смесь ферментов вносят стабилизатор осмотического давления и стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр. Процесс растворения клеточных стенок под действием литического комплекса может продолжаться от нескольких часов до 2 суток.

На образование протопластов, особенно у грибов и дрожжей, сильно влияет возраст культуры. Поэтому рекомендуется использовать молодые дрожжевые клетки и мицелий. По мнению многих авторов, различная возрастная чувствительность грибных клеток к действию литических ферментов объясняется скорее количественными изменениями в клеточной стенке, чем качественными,

Для облегчения процесса получения грибных протопластов можно использовать воздействие редуцирующих веществ (меркаптоэтанола, цистеина-HCl, сульфида натрия). Хотя механизм их действия на клетки полностью не выяснен, предполагается, что эти соединения разрывают дисульфидные связи в поверхностном маннан-протеиновом слое, облегчая этим доступность глюкановой матрицы действию литических ферментов.

Лизис грибных клеточных стенок может быть облегчен также обработкой клеток хелатирующими соединениями (Na-ЭДТА) или применением таких приемов, как замораживание-оттаивание. Лучшими стабилизаторами осмотического давления оказались 1 М раствор хлористого натрия и смесь 1 М раствора хлористого натрия с 1 М раствором маннита в соотношении 1:1.

В процессе культивирования протопласты и сферопласты способны увеличиваться в размерах, иногда даже на треть своей величины, и делиться. Деление протопластов может быть как равновеликое, так и неравновеликое, в виде почкования. Дочерние протопласты обычно меньшего размера. Протопласты, полученные из микробных клеток, сохраняют большинство их свойств. Они жизнеспособны в изотонической питательной среде при близких величинах осмотического давления среды и содержимого протопласта, способны метаболизировать и продуцировать различные вещества, поддерживать развитие бактериофагов, расти и делиться. Отсутствие оболочки исключает один из важных барьеров нескрещиваемости микроорганизмов, создает возможность объединения геномов и цитоплазмы для получения гибридного потомства даже у отдаленных форм микроорганизмов.

Поиск по сайту: