Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Типы культуральных систем



Непроточные культуры. Обычный тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. Эти системы пригодны для культивирования клеток как в монослое, так и в суспензии. По мере роста клеток в среде культивирования происходит исчерпание питательных веществ и накопление метаболитов – следовательно, среда должна постоянно меняться, что, в свою очередь, приводит к изменению клеточного метаболизма (физиологической дифференцировке). Системы непроточных культур характеризуются в той или иной степени накоплением отходов и непостоянством внешних условий.

Способы увеличения продолжительности жизни культур:

а) прерывистый – часть культуры заменяется равным объемом свежей среды;

б) постоянный – объем культуры постоянно увеличивается с низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются;

в) перфузионный – постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной бесклеточной среды.

Проточные культуры. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Это единственная система, в которой все клетки гомогенны и сохраняют гомогенность в течение длительно периода, что имеет очень важное значение в физиологических исследованиях. Однако использование таких культур для получения клеточных продуктов невыгодно с экономической точки зрения. Системы, пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

 

Монослойные культуры

Требования к поверхности субстрата. Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату (рис. 8) – к другим клеткам либо к стеклу (алюмоборосиликатное стекло, чаще модифицированное), пластику (полистирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и другие при условии правильной обработки этих полимеров – пластиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клетки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу – качественная нержавеющая сталь или титан.

 

Рис. 8. Прикрепление клетки к поверхности субстрата

 

Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культуральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхностной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеинами (наиболее изученным из которых является фибронектин, присутствующий в сыворотке и других физиологических жидкостях), а также присутствие двухвалентных катионов кальция и магния. Суммарный отрицательный заряд поверхности субстрата (например, за счет образования отрицательно заряженных карбоксильных групп) может достигаться предварительным воздействием химическими (окисляющие агенты) и физическими факторами (высоковольтный разряд, облучение УФ), что облегчает электростатическое прикрепление клеток. Поверхность культурального сосуда может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление клеток. К природным субстратам, на которых растут клетки, относятся коллаген и желатин. Для этих целей использую коммерческие препараты коллагена для культуры тканей (например, «Витроген 100»), что позволяет избежать утомительной процедуры получения коллагена из крысиных хвостов.

Культуральная посуда. Монослойное культивирование осуществляют во флаконах (флаконы Ру – самые большие стационарные флаконы, поверхностью до 200 кв. см) или пробирках для культуры тканей, обеспечивающих поверхность роста 5-200 кв. см.

Рост клеток в монослое. В случае монослойных культур необходимо проводить систематические пассажи клеток, используя для этого культуры предыдущего рассева или музейные клетки, сохранившиеся в условиях консервации. Полноценная популяция может быть получена только от генерации, состоящей из жизнеспособных клеток. Поэтому просмотр и оценка качества монослоя имеют решающее значение при выборе культур для пересева.

Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Когда две клетки приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфические движения клеточной мембраны. Первичные клетки, следовательно, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений. Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюдается также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии, но если их не пересеять, они погибают. Из сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способностью снимать контактное торможение.

Снижение распластывания клеток при достижении полного монослоя, а также ошаривание и прекращение роста клеток при их откреплении от подложки легли в основу представлений о тесной связи распластывания нетрансформированных клеток с их ростом.

Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки, трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности. Считается, что эти клетки утрачивают зависящую от плотности регуляцию. Трансформированные клетки способны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не наступает смена среды, то клетки быстро погибают.

Одним из факторов, лимитирующим рост клеток, является истощение в среде необходимых питательных компонентов. Следовательно, для получения высокой плотности клеток необходима периодическая замена питательной среды, а это может приводить к постоянному изменению состава среды, омывающей клетки, что весьма нежелательно.

Процесс подготовки клеточного монослоя к отделению от стекла и формированию суспензии (обработка клеток в монослое 0,02% раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1% трипсином и 0,01% ЭДТА) происходит при комнатной температуре в течение 5-10 минут в зависимости от типа культуры и ее индивидуального состояния. Как только клеточный монослой достаточно разрыхляется и начинает отделяться от стекла, раствор фермента сливают, а в культуральную посуду заливают определенное количество ростовой среды. Этой средой тщательно смывают клетки со стенки сосуда и легким пипетированием способствуют образованию гомогенной взвеси. Полученную взвесь после подсчета числа клеток разводят ростовой средой до посевной дозы и используют при новых пересевах.

Монослойные культуры имеют ряд преимуществ, являющихся предпосылками их широкого использования:

1. выделение секретируемого продукта многими клетками осуществляется эффективнее в случае их прикрепления к субстрату;

2. возможность быстрой и легкой замены питательной среды; возможность сопоставления времени и количества среды с периодом роста клеток или временем наработки продукта;

3. обеспечение наибольшей гибкости исследований, поскольку в монослой могут быть введены любые типы клеток;

4. достижение искусственно высокой плотности клеток с использованием перфузионной техники;

5. возможность использования одной и той же аппаратуры с разным отношением клетки-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.

 

Однако при использовании монослойных культут выявляются и недостатки:

1. сложность масштабирования;

2. отсутствие информативности визуального анализа;

3. трудности с определением и поддержанием таких параметров, как кислотность и содержание О2 и обеспечением гомогенности культуры клеток;

4. необходимость значительных пространств.

 




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.