Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Получение протопластов у бактерий



В 1800 г. А. Фишер впервые показал явление «плазмоптиза» – выхода содержимого клеток в окружающую среду при их помещении в гипертонический раствор – для бактерий Bacillus subtilis и Vibrio proteus. При этом протоплазма обособлялась в виде шарообразных тел, очень быстро исчезающих.

Основная работа по получению протопластоподобных тел у бактерий началась в начале 50-х годов прошлого века. В эти годы с использованием гипертонических растворов различных солей было обнаружено влияние условий культивирования клеток на выход шарообразных форм. Было установлено значение концентрации шаров (чем гуще суспензия, тем интенсивнее образование шаров) и влияние рН среды (слабокислая и нейтральная реакция способствовали образованию шаров, в то время как при кислой и щелочной реакции шары не образовывались). Однако целостность полученных шарообразных форм сохранять не удавалось, они быстро лизировались.

Следующим шагом в получении протопластоподобных структур явилось ферментативное растворение бактериальной клеточной стенки при помощи гидролитического фермента лизоцима. Толчком к этому послужил установленный M. R. J. Salton факт растворения под действием лизоцима клеточных стенок грамположительных бактерий. Однако и в этих экспериментах протопластоподобные тела оказывались очень неустойчивыми.

Этого удалось избежать С. Weibull, который обрабатывал бакте-риальные клетки лизоцимом в гипертоническом растворе сахарозы. Полученные им сферические тела долгое время сохраняли свою целостность при условии помещения их в среду со стабилизатором осмотического давления. С. Weibull назвал полученные сферические образования протопластами, употребив термин, применявшийся ранее в цитологии растений.

Установлено, что на активность лизоцима могут оказывать влияние вещества, используемые в качестве стабилизаторов осмотического давления. Например, использование 0,5 % NaCl тормозит действие лизоцима на клетки. Лучшими стабилизаторами для получения бактериальных протопластов считаются углеводы. Чаще всего применяют 0,1 – 0,6М растворы сахарозы, глюкозы, раффинозы, мелибиозы, трегалозы.Иногда используют и более высокие концентрации сахаров.

Для получения протопластов грамположительных бактерий достаточна простая обработка клеток лизоцимом в гипертоническом растворе. Под действием этого фермента растворяется ригидный пептидогликановый слой клеточной стенки. При этом чувствительность к лизоциму не одинакова не только у разных видов бактерий, но и среди разных штаммов.

Для получения протопластов грамотрицательных бактерий простая обработка лизоцимом малоэффективна. В клеточных стенках этих бактерий тонкий слой пептидогликана окружен внешним слоем, состоящим из лигопротеинов, фосфолипидов, липополисахаридов, что делает его недоступным действию лизоцима. Для проникновения фермента к субстрату необходимо нарушение поверхностных слоев клеточной стенки.

Подготовка клеток грамотрицательных бактерий для воздействия лизоцимом проводится с помощью различных методов, повышающих чувствительность клеток: путем предварительной инкубации бактерий в жидкой питательной среде при щелочном рН или в присутствии высоких концентраций сахарозы; обработка клеток хелатирующими соединениями (например, Na-ЭДТА) или одно- и дивалентными катионами; применение предварительного замораживания-оттаивания.

Наиболее удачным оказался метод, предложенный Р. Репаске и до сих пор применяемый для получения протопластов у разных видов грамотрицательных бактерий. Автор показал возможность получения протопластов при совместном действии лизоцима и ЭДТА в среде с рН 7,6-8,0.

В 1976 г. Р. Вейсс предложил ускоренный метод получения протопластов кишечной палочки с использованием ЭДТА, модифицировав метод Репаске. Он применил не совместное действие на клетки лизоцима и ЭДТА, а последовательное

Вместо лизоцима в качестве факторов, лизирующих клеточные стенки бактерий, можно использовать также литические ферменты микробного происхождения.

Вторая группа методов получения протопластов у бактерий предусматривает не разрушение готовых клеточных стенок, а ингибирование их синтеза (методы «несбалансированного роста»). Метаболические нарушения при синтезе клеточных стенок происходит в двух случаях: 1) в результате мутации может возникнуть генетический блок в цепи реакций, ведущих к синтезу полимеров клеточной стенки; 2) при нарушении синтеза клеточной стенки под действием агентов, предотвращающих образование ригидного мукополимера.

Целостность клеточных стенок у некоторых бактерий зависит от наличия в ростовой среде мукополимерных аминокислот - ДАП, цистеина, аланина, лизина, глицина, орнитина, и глутаминовой кислоты. Когда они исчерпываются в процессе роста клеток, синтез клеточных стенок приостанавливается (Streptococcus faecalis).

Одним из широко распространенных методов получения протопластов у грамотрицательных бактерий является так называемый пенициллиновый метод, основанный на свойстве пенициллина нарушать синтез пептидогликана. (Впервые предложен К. Ледермейстером и Е. Келленбергером в 1956 г.). Пенициллиновый метод не эффективен в тех случаях, когда в клетках подавлен синтез активных цитоплазматических компонентов, например при воздействии на клетки хлорамфениколом, стрептомицином или хлортетрациклином. Действие пенициллина на активно растущие клетки сводится к торможению реакции транспептидирования на последней стадии синтеза пептидогликана, после того как этот полимер почти построен.

Для получения протопластов грамположительных бактерий пенициллиновый метод непригоден. Объясняется это тем, что мукополимерный слой в клеточной стенке этих бактерий не защищен дополнительными слоями, как у грамотрицательных бактерий, и при культивировании с антибиотиком клетки претерпевают лизис. Однако имеются отдельные сообщения об успешном применении метода для получения протопластов у Corynebacterium glutamicum, для которых другие методы были неэффективны.

Помимо указанных способов, протопласты у бактерий могут быть получены и другими методами: под влиянием глицина, фагового литического фермента, нормальной и иммунной сывороток, комплимента, методом автолиза и т. д.

Протопласты, полученные из грамотрицательных и грамположительных бактерий, по качеству оставшихся поверхностных структур различаются между собой. У протопластов грамположительных бактерий клеточная стенка отсутствует полностью, и их сферические тела окружены лишь цитоплазматической мембраной. Сферические тела грамотрицательных бактерий сохраняют значительную часть сложноорганизованной клеточной стенки и называются сферопластами.

 




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.