Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Монослойное культивирование на микроносителях



Сочетать положительные стороны монослойного и суспензионного культивирования позволяет использование системы с микроносителями. Микроносители – мелкие твердые частицы (поддерживаемые в суспензии благодаря перемешиванию), на поверхности которых клетки растут в виде монослоя. Использование микроносителей дает клеткам, обладающим адгезивными свойствами, все преимущества крупномасштабных суспензионных культур.

Микроносители должны быть нетоксичными, не сорбировать компоненты питательных сред и продукты метаболизма клеток, а также иметь поверхностный заряд или обменную емкость, достаточную для прикрепления клеток. Коммерческие микроносители имеют диаметр 100-200 мкм и подразделяются на 6 основных групп:

1. декстрановые микроносители поперечно сшитые типа Cytodex 1;

2. декстрановые микроносители типа Cytodex 2;

3. микроносители, покрытые коллагеном или желатином типа Cytodex 3;

4. полистиреновые микроносители типа Biosilon, Cytospheres;

5. стеклянные микроносители типа Bioglass;

6. целлюлозные микроносители типа ДЕ-53.

 

Используемые в настоящее время микроносители на основе микропористого желатина или пористого боросиликатного стекла имеют емкость около 3000 клеток/микроноситель.

Питательные среды

Оптимизация состава питательных сред для культур животных клеток развивалась в двух направлениях – разработка сред, требующих внесения природных добавок (сыворотки, эмбриональные экстракты и др.), и создание сред химически определенного состава.

В настоящее время наиболее широко применяются среды, содержащие источники энергии (углеводы) и азота; незаменимые аминокислоты; витамины; неорганические соли – источники макро- и микроэлементов, включая селенит; нуклеозиды; жиры и жирорастворимые компоненты; гормоны (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды, эстроген, андроген, тироксин, трииодтиронин); ростовые факторы (фактор роста, синтезируемый тромбоцитами, фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса), а также сыворотку (до 10%) и в ряде случаев некоторые другие добавки (бактопептон, триптозофосфат и т. п.).

В 40-50-е годы прошлого века большая часть клеток выращивалась в плазме или на фибриногеновом сгустке в присутствии тканевых экстрактов или их ультрафильтратов. Начиная со среды 199, предложенной Г. Мортоном в 1950 году и содержащей более 60 синтетических ингредиентов, широко осуществляется подбор состава и методов приготовления различных питательных сред. В своей классической работе в 1955 году Х. Игл исследовал потребности клеточных линий мышей L и HeLa в питательных веществах. Это злокачественные клетки, характеризующиеся различным кариотипом и сходные по своей морфологии с клетками плоского эпителия. Игл использовал среды определенного состава, содержащие смесь аминокислот, витаминов, солей и углеводов, а также небольшое количество диализированной сыворотки лошади или человека. В ходе исследований 27 факторов были определены как незаменимые для роста. Они составили основу среды, известной как «базальная среда Игла», или БСИ. Из 20 аминокислот 13 оказались незаменимыми, а остальные 6 могли быть синтезированы клетками из других источников углерода. Удаление любого из 7 витаминов приводило к развитию симптомов недостаточности. Таким образом, Игл, используя метод культивирования клеток, продемонстрировал питательные потребности клеток мыши и человека. Вскоре БСИ была заменена минимальной средой Игла (МСИ), в которой концентрация различных компонентов была повышена, что обеспечивало непрерывный рост клеток в культуре в течение нескольких суток без смены среды. Указанные среды широко используются для культивирования различных клеточных линий. Сыворотка в их составе служит источником не идентифицированных факторов.

До сих пор нет общего мнения относительно роли сыворотки в клеточных культурах, как нет и общего мнения относительно физиологической роли некоторых ее компонентов. Считается, что сыворотка обеспечивает клетки гормональными факторами, стимулирующими их рост и функции, служит источником низкомолекулярных соединений, требующихся клеткам в очень малых дозах и переносимых сывороточными белками, а также обеспечивает клетки незаменимыми соединениями. В конце 50-х годов было показано, что ά-глобулиновая сывороточная фракция (фетуин) способствует прикреплению клеток к стеклу и их распластыванию, т.е. процессам, необходимым для размножения клеток. В сыворотке содержатся коллаген и фибронектин. В 70-х годах исследователей заинтересовала роль сывороточного альбумина в культурах в связи со способностью этого белка служить переносчиком для небольших молекул гормонов, которые могут стимулировать in vivo или in vitro рост различных типов клеток.

Однако, культивирование клеток в присутствии сыворотки обнаруживает ряд недостатков:

1. Для большинства клеток сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой они контактировали в исходной ткани;

2. Часто недооценивается возможность цитотоксичности сыворотки;

3. Сыворотки могут содержать недостаточное количество специфических для данного вида клеток ростовых факторов;

4. Возможны изменения свойств сыворотки от партии к партии.

В настоящее время предпринимаются попытки создания и применения бессывороточных питательных сред, в которых сыворотка заменяется смесью гормонов (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды и др.) и ростовых факторов. Эти среды необходимы, если по условиям эксперимента требуется избежать присутствия чужеродного белка и из-за высокой стоимости эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Однако в настоящее время бессывороточные среды имеют существенные недостатки: добавление в дешевую среду гормонов и факторов роста делает ее такой же дорогой, как среда с сывороткой. Кроме того, чаще всего бессывороточные среды пригодны для ограниченного числа клеток.

Одна из проблем, возникающих при попытках получить культуры одиночных клеток или культуры клеток с низкой плотностью (100 кл\мл), заключается в том, что в этих условиях клетки погибают или растут очень медленно. В результате подробных исследований была разработана концепция “кондиционированной среды”. Кондиционированная среда – это среда, в которой концентрация метаболитов находится на таком уровне, что наступает равновесие между выходом метаболитов из клеток в среду и обратным захватом этих метаболитов клетками.

 




©2015 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.