Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Динамический анализ функции тромбоцитов




Новым подходом в лабораторной диагности­ке является имитирование тромбоцитарного гемо­стаза на приборе PFA-100® (фирма «Dade Behring», Германия). В PFA-100 в измерительном картрид­же цитратная кровь пропускается через капилляр диаметром 150 мкм, моделирующий микрососуд, покрытый пленкой из коллагена/адреналина или коллагена/АДФ (рис. 73-74). Это сопровождается образованием тромбоцитарной пробки, что оце­нивается по перфузионному давлению. Останов­ка перфузии фиксируется как «время окклюзии сосуда». Метод позволяет эффективно с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять дефицит фактора Виллебранда, функциональные нарушения тромбоцитов, вызванные аспирином, наследственные и приобретенные нарушения ад­гезии и агрегации тромбоцитов. С применением


2 агонистов (индукторов агрегации) возможно се­лективное выделение аспириновых тромбоцитопа-тий. По типу измерения PFA-100 является дина­мическим агрегометром.

На практике трудно наработать материал с первичным нарушением гемостаза, чтобы уста­новить референтные значения теста, так как боль­ных с однородными нарушениями достаточно мало. При тромбоцитопатиях, вызванных дли­тельным приемом антитромбоцитарных препара­тов, очень много различных вариантов измене­ний первичного гемостаза. Тем не менее метод по­зволяет выявлять ранние признаки нарушений первичного гемостаза и, по-видимому, имеет большие перспективы для внедрения в коагуло-логические лаборатории и лаборатории экспресс-диагностики.




 


Рис. 73. Динамический агрегометр PFA-1OO.Он позво­ляет наблюдать in vitro за процессом закупорки сосуда при моделировании этого процесса в специально созданном картридже. Образование тромбоцитарной пробки оцени­вается по перфузионному давлению


Рис. 74. Датчик динамического агрегометра PFA-1OOсо­держит капилляр, моделирующий микрососуд. В цельной кро­ви, проходящей по капилляру, активируется образование сгу­стка, На стенках нанесен коллаген и адреналин или АДФ, которые являются первичной причиной запуска гемостаза


Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Тромбоцитарные показатели


Число тромбоцитов (Platelets, PL, PLT)

При подсчете на автоматических анализато­рах тромбоциты распознаются по размерам в ди­апазоне 2-20 фл (рис. 75). Автоматические счет­чики позволяют получать достаточно надежные результаты по количеству тромбоцитов. При под­счете тромбоцитов в камере Горяева коэффици­ент вариации составляет 7-15%, тогда как авто­матический подсчет воспроизводится с точностью до 2-4%. Современные анализаторы сигнализи­руют (флагирование на бланке) о выходе количе­ства тромбоцитов за референтные пределы, на­личии агрегатов тромбоцитов, макротромбоци­тов или других элементов, сравнимых по объему с тромбоцитами (микроэритроциты).

Ложное занижение числа тромбоцитов может быть при их агрегации, агглютинации под дей­ствием тромбоцитарных агглютининов и при прилипании тромбоцитов к лейкоцитам (тромбо-цитарный «сателлитизм»). При подсчете на гема­тологических анализаторах в качестве антикоа­гулянта используется ЭДТА. При наличии ауто-антител к тромбоцитам калиевая соль ЭДТА ини­циирует агрегацию тромбоцитов, что проявляет­ся псевдотромбоцитопенией.


Средний объем тромбоцита (MPV)

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и нахо­дится в обратной зависимости от числа тромбо­цитов. Такое соотношение определяет постоянство тромбоцитарной массы в циркулирующей крови. MPV увеличивается с возрастом; отмечено, что у мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагу­лянта вызывает изменение формы тромбоцитов от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличивать­ся, а при высокой концентрации (1:4) - не изменя­ется со временем. Кроме типа применяемого ан­тикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние тем­пература окружающей среды. Преходящее увели­чение MPV отмечается у рабочих, контактирую­щих с асфальтовыми испарениями, органически­ми растворителями. MPV - важный диагностичес­кий показатель функции тромбоцитов. Причины изменения MPV представлены в табл. 13.

Таблица 13

Причины изменения MPV


 


 


Рис. 75. Гистограмма тромбоцитов,которая изобража­ется при представлении результатов счета клеток крови на гематологических анализаторах, Помимо гистограммы, ге­матологические анализаторы представляют результаты подсчета количества тромбоцитов (PLT), среднего объема тромбоцитов (MPV), дисперсии распределения тромбоци­тов по объему (PDW), тромбоцитокрита (РСТ)


Дисперсия распределения тромбоцитов по объему (PDW)

PDW - показатель, являющийся мерой ге­терогенности размеров (анизоцитоза) тромбо-


Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ


 


мов тромбоцитов или произведением среднего объема тромбоцитов на их число:

цитов. Величина PDW в среднем составляет 10-15%.

Как артефакт, ложнозавышенное увеличение PDW может быть связано с присутствием микро-цитов, шизоцитов, микроагрегатов тромбоцитов, фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

Этот показатель находится в обратной зави­симости от числа тромбоцитов и их периода жиз­ни. В каждом конкретном случае важна не толь­ко величина PDW, но и ее динамика во времени, а также связь с другими тромбоцитарными по­казателями. Так, увеличение PDW с одновремен­ным снижением MPV свидетельствует о преоб­ладании микротромбоцитов среди общей попу­ляции тромбоцитов (указывает на угнетение тромбоцитопоэза), а сочетание повышенного PDW с увеличением MPV отражает нарастание числа макротромбоцитов (усиление продукции тромбоцитов). Одновременное присутствие фракций макротромбоцитов и микротромбоци­тов ведет к увеличению PDW, но MPV может ос­таваться в пределах нормы. В современных ге­матологических анализаторах отдельными пока­зателями указывается процентное содержание микротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбо­цитов (MacroPLT).

PDW может применяться для дифференци­альной диагностики. Так, увеличение PDW свы­ше 10,5% было обнаружено у 50% больных эссен-циальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с ре­активным тромбоцитозом и лишь у 14% здоро­вых людей.

Тромбоцитокрит (РСТ)

РСТ - показатель, характеризующий процент тромбоцитарной массы в объеме крови: вычис­ляется суммированием прямо измеренных объе-


У здорового человека показатель стремится остаться стабильным: при уменьшении числа тром­боцитов усиливается тромбопоэз, в циркулирую­щую кровь выбрасывается большее число моло­дых макротромбоцитов, что ведет к увеличению MPV. При увеличении количества циркулирую­щих тромбоцитов снижается продукция их в кост­ном мозге, тем самым уменьшается процент мак­ротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако при нарушении этого равновесия происходит или уменьшение РСТ, что в конечном счете приводит к патологии первичного гемостаза и риску возник­новения кровотечений, или повышение РСТ, уве­личивающее активность тромбоцитов и их способ­ность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

Нормальные значения РСТ варьируют в пре­делах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что сниже­ние РСТ менее 0,1% обусловило возникновение послеоперационных кровотечений у пациентов с развившейся тромбоцитопенией. Также было от­мечено, что этот показатель оказался более чув­ствительным для оценки риска возникновения кровотечения, чем число тромбоцитов.

Если скрининговые методы указывают на нарушение функции тромбоцитов, необходимо выполнить специальные тесты с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых паци­ентом (отмена за 7-10 суток перед исследовани­ем глюкокортикостероидов, аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств, адреноблокаторов, блокаторов кальциевых кана­лов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаве­рина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина, антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).


 


Агрегация тромбоцитов


Агрегацию тромбоцитов исследуют на агре-гометре с использованием индукторов агрегации. Требования к пробам критичны. Исследование агрегации проводят на плазме, богатой тромбо­цитами (ПБТ, английская аббревиатура PRP). Желательно использовать ПБТ, содержащую примерно 200 клеток/нл. Это требование затруд-


няет оценку агрегации тромбоцитов при тромбо-цитопении.

Пробы помещаются в кювету агрегометра, который представляет собой оптический прибор с регистрацией проходящего света. Проба в кю­вете постоянно перемешивается специальной ме­шалкой. При формировании агрегатов повыша-


Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ


 


ется прозрачность плазмы и, следовательно, уве­личивается поток проходящего через кювету све­та (рис. 76). Изменение светопропускания регис­трируется в виде кривой.

Агрегация с АДФ

Характер агрегации тромбоцитов при ин­дукции АДФ зависит от дозы. Как правило, при концентрации 0,5-1 мкмоль возникает обрати­мая агрегация, при концентрации до 5 мкмоль -двухфазная агрегация, при большей концентра­ции (до 10 мкмоль) - необратимая однофазная агрегация (или агрегация, при которой неразли­чим переход от 1-й до 2-й волны).

При связывании на поверхности тромбоци­тов АДФ с рецептором происходит изменение формы тромбоцитов, экспозиция на мембране комплекса GPIIb-IIIa (рецептор для фибриноге­на) и первичная Са-зависимая агрегация. Если первичный ответ на АДФ не будет поддержан вторичной реакцией, то в отсутствии фибриноге­на происходит десенситизация рецепторов, кото­рая приводит к дезагрегации тромбоцитов. Вто­ричная агрегация опосредована внутриклеточной передачей сигнала через G-белки с повышением внутриклеточной концентрации Са2+. Происхо­дит активация простагландин-тромбоксановой системы, развивается секреция из α-гранул vWF, β-тромбоглобулина, тромбоспондина, фибронек-тина и других активных компонентов, развива­ется вторичная агрегация.

Выяснение путей АДФ-активации тромбоци­тов позволило использовать в клинике антиагре-гационные соединения. Оказалось, что тиклопи-


дин и клопидогрель селективно ингибируют ак­тивацию G-белка, АДФ-агрегацию и активность стимулированной аденилатциклазы.

Агрегация с адреналином

Особенности агрегации с адреналином в зна­чительной степени обусловлены концентрацией Са2+ в среде. При физиологических концентра­циях Са2+ (1-2 ммоль, которая характерна для плазмы крови) адреналин не вызывает актива­ции тромбоцитов и их агрегации. При значи­тельном снижении Са2+ в цитратной плазме до 20-40 мкмоль адреналин вызывает дозозависимую агрегацию с экспрессией комплекса GPIIb-IIIa при первичной волне агрегации и ТХА2-опосре-дованную вторичную волну (рис. 28).

По-видимому, в условиях организма прямая адреналиновая агрегация отсутствует, что связа­но с относительно высокой концентрацией Са2+ в плазме и низкой концентрацией самого адрена­лина. Однако адреналин, очевидно, потенцирует действие других агонистов, что проявляется уже при его концентрации порядка 0,01 мкмоль. По­этому при курении, стрессе и особенно кардио-генном шоке, когда уровень адреналина в крови повышается до 0,6 мкмоль, он становится суще­ственным фактором внутрисосудистой агрегации тромбоцитов.

Агрегация с тромбином

Тромбин - очень сильный физиологический индуктор агрегации. Воздействие тромбина на тромбоцит опосредовано собственным рецепто-


 



Рис. 76. Принцип оценки индуцированной агрега­ции. А- до агрегации; Б -агрегация. После добавле­ния индуктора агрегации и формирования агрегатов тромбоцитов происходит просветление суспензии


Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ


ром (рис. 20) и GPIbα. Стимуляция тромбиново-го рецептора сопровождается активацией тром­боцитов через G-белок, фосфолипазы С и вклю­чение фосфоинозитольного механизма актива­ции. Этот путь сопровождается быстрым увели­чением концентрации цитозольного Са2+ и сек­рецией α-гранул и электронно-плотных 5-гранул. Секретируемый из 5-гранул АДФ существенен для образования агрегатов, а выделяемые α-гра-нулами фибриноген, vWF, тромбоспондин - для их стабилизации. Оккупация молекулами тром­бина высокоаффинных рецепторов GPIbα приво­дит к перестройке фосфолипидной мембраны, стимуляции ее прокоагулянтной активности и повышению аффинности GPIIb-IIIa. В результа­те комплексной стимуляции тромбином практи­чески не наблюдается двухволновой агрегации.

Агрегация с арахидонатом

Арахидоновая кислота в цитратной плазме вызывает дозозависимое изменение формы тром­боцитов, первичную и вторичную агрегацию. Арахидонат активирует тромбоциты без участия специфических рецепторов, проникая внутрь клетки, активируя свои метаболиты - ПГG2,


ПГН2 и тромбоксан. Эту особенность активации тромбоцитов арахидоновой кислотой использу­ют для дифференциации нарушений, связанных с дефицитом пулов хранения и нарушениями в цик-лооксигеназном пути активации тромбоцитов.

Вид агрегатограммы зависит от типа и концен­трации индуктора. Наиболее распространенные индукторы АДФ и адреналин используются в не­скольких концентрациях. Форма агрегатограммы может быть несколько отлична на агрегометрах разных производителей, так как выводимый резуль­тат теста в определенной степени зависит от скоро­сти и характера перемешивания, температуры, спо­соба регистрации и некоторых других факторов.

Лекарственные средства, такие, как аспирин и другие нестероидные противовоспалительные препараты, антибиотики (3-лактамного ряда, не­которые витамины, пряности могут быть причи­ной нарушенной агрегации. Из вышесказанного следует, что для адекватной оценки результатов теста требуется тщательная стандартизованная подготовка больных и стандартизация протоко­ла аналитических процедур.

Болезнь Виллебранда и врожденные наруше­ния функции тромбоцитов легко диагностируют­ся агрегатометрией (табл. 14).


 


Изменения агрегатограмм при нарушениях функции тромбоцитов


Таблица 14


 



Н- нормальная агрегатограмма, 4- - сниженная реакция на индуктор агрегации.


 


 


Клинический пример 2

Мальчик А. 6 лет. Обратился за помощью по поводу носового кровотечения. Со слов ро­дителей - единственный ребенок в семье, име­ющий геморрагические проявления в виде кож­ного гемосиндрома, гемартрозов и носовых кровотечений. Ребенок наблюдается по месту


жительства с диагнозом гемофилия А. При но­совых кровотечениях и гемартрозах получает переливания цельной крови с положительным эффектом. При осмотре, помимо кровотечения из полости носа, выявлен кожный гемосиндром смешанного типа - гематомы, экхимозы, пете-хии и пурпурозные элементы. Для оказания эк­стренной помощи был введен концентрат фак-


Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ


тора VIII, после чего кровотечение останови­лось, однако рецидивировало через несколько часов. С учетом характера кожного гемосинд-рома диагноз гемофилии А вызвал сомнения. Необходимо было проводить дифференциаль­ный диагноз между коагулопатией, болезнью Виллебранда и нарушением тромбоцитарного гемостаза. Было проведено коагулологическое обследование.


Результаты: время кровотечения значитель­но удлинено, количество тромбоцитов 150 х 109/л. ПТ-тест 155%, АЧТВ 31 с (норма 28-43 с), ф.УШ >200%, ф.1Х 195%, ристоцетин-кофакторная ак­тивность 71%. Агрегация тромбоцитов с АДФ, коллагеном и адреналином отсутствует, агрегация тромбоцитов с аггристином нормальная. Данные обследования позволили поставить диагноз: тромбастения Гланцмана.


 


 


 




Поиск по сайту:

©2015-2020 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.