Під впливом гуманістичних і реформаційних ідей на рубежі XVI–XVII ст. відбуваються вагомі зміни в освіті. До кінця XVI ст. визначальними у шкільній справі на українських землях залишалися візантійські традиції: школа при церкві (або монастирі), дяк ("дідаскал", "майстер", "бакалавр") – шкільний вчитель, богослужебні книжки – підручники, програма навчання – буквар, церковний спів і письмо, мова навчання – церковнослов’янська.
На початку XVI ст. на терени України проникає реформаційних рух, направлений прати католицької церкви. Найбільш відчутними впливи Реформації стають у 50-х роках XVI ст. Реакцією католицької церкви на Реформацію була контрреформація. Зокрема, у 1568 р. в українських землях розпочав діяльність орден єзуїтів (заснований у Парижі у 1534 р.). Ним було створено ряд шкіл: у Перемишлі, Фастові, Острозі, Львові, Вінниці. В Україні згодом діяло 23 єзуїтські колегії.
Єзуїти відкривали елементарні та середні школи й колегії з двома відділеннями – нижчим і вищим. До нижчого відділення належали гімназії, що мали п’ять класів. На вищому відділені три роки вивчалася філософія і чотири роки – богослов’я. Освітні заклади організовувалися на зразок західноєвропейських вищих шкіл, в яких учні здобували найвищу освіту в межах Речі Посполитої. У 1569 р. єзуїтами була заснована Віленська колегія, яка вважалася найбільшим навчальним закладом Східної Європи. Польський король Стефан Баторій надав колегії права Академії, тобто дозвіл викладати богословські науки. Першим ректором Академії папа римський призначив Петра Скаргу – активного діяча єзуїтів.
Єзуїти створили в Європі найпрогресивніші навчальні заклади і за програмою, і за методикою, і за вимогами до педагогів. Вони забезпечували освіту вищого європейського ґатунку. Такі школи були спокусливими для шляхти новими предметами, шкільним театром. Українці, які не мали рівноцінних православних шкіл, віддавали своїх дітей до цих колегій, де ті майже повністю втрачали усі ознаки національної ідентичності.
На противагу єзуїтській освіті багатий і впливовий магнат, князь Костянтин Острозький заснував 1576 р. у м. Острзі культурно-освітній центр нового типу. До нього входили колегія, літературно-науковий гурток, бібліотека і друкарня, яку протягом 1577–1582 рр. очолював відомий першодрукар Іван Федоров. Це по суті була перша вища школа європейського зразка в українських землях, що згодом дістала назву Академії. Першим ректором Академії був Герасим Смотрицький, письменник-полеміст і культурно-освітній діяч XVI ст. В Острозькому культурно-освітньому центрі викладання поєднувалося з науковою, перекладацькою й видавничою діяльністю. Навчання здійснювалося за поширеною у Європі системою "Семи вільних мистецтв". Тут вивчалися богослов’я і філософія, математика і астрономія, діалектика і логіка, старослов’янська, польська, грецька та латинська мови.
Острозька академія (1580–1608) протиставила польській експансії вітчизняну систему духовних цінностей. Академія, яку називали "трьохмовним ліцеєм", "храмом муз", стала початком реального компромісу між традиціями ("грецьким благочестям") і новаціями ("латинською наукою"). Вона була навчальним закладом нового типу – слов’яно-греко-латинською академією. З Острозької академії вийшло багато видатних людей: Гаврило Дорофієвич, Йов Княгинецький, Мелетій Смотрицький, Ісайя Копистенський, Петро Конашевич-Сагайдачний. За час дії цього навчального закладу його закінчили близько 500 осіб, які стали вчителями, літераторами, друкарями, проповідниками.
Острозька академія залишила по собі значний слід в історії освіти й духовного життя України. Найвагомішою культурною пам’яткою Острозької академії було видання повної художньо ілюстрованої Біблії слов’янською мовою в 1581 р., текст якої вживався при богослужінні у православних церквах. За зразком Острозької академії вищі школи були створені в Турові – 1572 р., Володимирі-Волинському 1577 р., Слуцьку – 1580 р., Львові – 1586 р. Навчання в цих школах було доступне для дітей "всякого стану", убогих і багатих.
Окреме місце серед шкіл цього періоду займає польська Замойська академія, відкрита Яном Замойським у 1595 р. в західноукраїнському місті Замостьє. Фундатор академії вилучив із її програми богослов’я. Академія складалася з восьми класів. Бідних студентів не лише звільняли від плати за навчання, але й утримували в бурсі за рахунок фундатора. Студенти поділялися за національністю на п’ять груп: польська, литовська, руська, пруська та чужоземська. У школі вивчалися цивільне і публічне право; філософія; фізика; логіка і метафізика; математика; риторика і динаміка; поезія і синтаксис; антологія та орфографія. Після смерті фундатора Замойська академія встановила чотири факультети: теологічний, правничий, філософський та медичний. Академія перестала існувати з часу першого поділу Польщі (1772 р.). Із Замойської академії вийшли Касіян Сакович, ректор Київської братської школи; Ісая Трофимович-Козловський, ректор Києво-Могилянської колегії; Сильвестр Косів, перший проректор цієї ж колегії.
Велику роль в організації культурно-освітніх установ відіграли братства – національно-релігійні громадські організації православного міщанства. Зокрема, у 1585 р. свою школу організувало Успенське братство Львову. Предмети викладалися тогочасною українською мовою. Викладали слов’янську та грецьку мови, а також "вільні науки". У 1586 р. тут було складено "Порядок шкільний", у якому, зокрема, викладено педагогічні вимоги до вчителя.
"Дидаскал або вчитель цієї школи повинен бути благочестивий, розумний, смиренномудрий, скромний, не хабарник, не грошолюб, не гнівливий, не заздрісник, не насмішник, не соромітник, не чародій, не казкар, не пособник єресей, а прихильник благочестя, добрих справ, що в них себе проявляє, а не лише в таких чеснотах, то й учні будуть такі, як їх учитель …
Учитель же, взявши доручену йому дитину, повинен навчати її свідомо доброї науки, за непослух карати не по-тиранські, а по-вчительські, не надмірно, а посильно, не розбещено, а спокійно й смиренно, не тільки по-світськи, а й вище світських …
Навчати й любити учитель повинен всіх однаково, як синів багатих, так і сиріт убогих…"
В цілому, в епоху "культурно-національного відродження" система просвіти виконувала не тільки пізнавальні та виховні функції, а значно більш широкі соціокультурні завдання, виступала засобом боротьби за віру і національне самовизначення.
На початку XVII ст. активізується рух зі створення братських шкіл у Центральній Україні. У 1615 р. було створено Київську братську школу, яка стала ідейно-культурним осередком національно-визвольної боротьби українського народу. Першим її ректором став Іов Борецький. У Київській братській школі вивчали грецьку, латинську, слов’янську, польську мови, а також поетику, риторику, філософію.
Діяльність Київського братства підтримувало Військо Запорізьке. У 1615 р. гетьман П. Конашевич-Сагайдачний з "усім військом запорізьким" вступив до Київського братства і взяв під захист братську школу. Кожний козак вносив 6 грошів вступних і 1,5 гроша щомісячно, які йшли на потреби братства та розвиток освіти. Майже всі свої кошти гетьман заповів Київській, Львівській і Луцькій братським школам.
Узагалі, козацтво відіграло значну роль у розвитку освіти в Україні. На думку Д. Яворницького, більшість січового війська за своєю грамотністю і начитаністю стояла так високо, що переважала у цьому відношенні середній, а, може, і вищий стан людей свого часу. На землях Війська Запорізького низового були школи, які поділялися на січові, монастирські і церковнопарафіяльні. У січовій школі навчалися хлопчики, які з різних причин потрапили на Січ. Січові школярі вчилися читати, писати і співати. Вони обирали зі свого середовища двох отаманів – одного для підлітків, другого для малолітніх. Головним учителем січової школи був ієромонах-уставник, який, окрім своїх прямих обов’язків наставника, повинен був турбуватися про здоров’я хлопчиків. Про всі надзвичайні випадки у школі він повинен був доповідати кошовому отаману. Школа монастирська існувала при Самарсько-Миколаївському монастирі й виникла разом з першою його церквою близько 1576 р. Школи церковнопарафіяльні існували майже при всіх церквах у паланках, по слободах, зимівниках і хуторах.
Видатну роль в розвитку української культури, зокрема, освіти, відіграв архімандрит Києво-Печерської Лаври Петро Могила (1596–1647). Він народився в Молдавії. Його батько, Симеон, був господарем Валахії, а згодом Молдавії. Освіту П.Могила здобув у Львівській братській школі, а потім навчався в університетах Польщі, Франції. Офіцером польської армії брав участь у битвах під Цецорою, Хотином. Після обрання в 1627 р. архімандритом Києво-Печерської лаври П.Могила домагається у польського короля легального становища в Україні православної церкви поряд з уніатською, а також передачі їй Софійського собору, Видубицького монастиря, інших культових православних споруд.
Будучи київським митрополитом з 1632 р., за короткий час П.Могила надав українській православній церкві чітку організаційну структуру, здійснив реформу церковного обряду, систематизував догматику (він видав першу на східнослов’янських землях догматичну синтезу під назвою "Православное исповедание кафолической и апостольской церкви восточной"), підняв освіту духовенства. Реставрував Софійський собор, Києво-Печерський монастир, з його ініціативи почалися розкопки Десятинної церкви, що можна кваліфікувати як першу спробу археологічних досліджень Києва.
З іменем П.Могили пов’язане розгортання вищої і середньої освіти в Україні, зокрема створення Київського колегіуму шляхом злиття Київської братської школи та заснованої ним же в 1631 р. Лаврської вищої школи. Він дбав про розвиток Києво-Печерської лаврської друкарні, сприяв письменникам і художникам, дбав про поширення книгодрукування у Валахії і Молдавії, сам підготував 29 творів церковно-теологічного, полемічного, філософського та моралізаторського характеру. Все своє майно, кошти, бібліотеку, митрополиче вбрання, оздоблене коштовностями, П.Могила заповів Києво-Могилянській академії. Останніми його словами були: "Бережіть академію". Символічно те, що в незалежній Україні внесок П.Могили у створення вищої освіти увіковічено запровадженням вищої нагороди МОН України – медалі імені П.Могили.
Таким чином, у першій половині XVII ст. в Україні вже існувала розгалужена мережа навчальних закладів. Високий рівень культури й освіченості українців у цей період відзначали чужоземці, які побували в Україні. Зокрема, Павло Алепський, який у 1653 р. проїздив Україною, відзначав: "Починаючи з Рашкова, по всій козацькій землі дивовижний і добрий факт спостерігали ми: всі вони, за невеликим винятком, грамотні, навіть більшість їхніх дружин і дочок уміють читати й знають порядок служб церковних і церковний спів, священики навчають сиріт і не дають їм блукати неуками по вулицях".