В останні роки в ряді економічно розвинених країн світу виникла нова галузь мікробіологічної промисловості, основне призначення якої - одержувати додаткові кормові продукти, насичені білком і вітамінами. З мікроорганізмів, як правило, найбільше часто використають дріжджі, а основним вуглець містким компонентом середовища є вуглеводні, переважно н-алкани. Асиміляція вуглеводнів має свої специфічні особливості не тільки по механізму окислювання н-алканів, але й по механізму транспорту, а також локалізації в клітині. Очевидно, дріжджові клітини, що відносяться до родів Candіda Torulopsіs, не мають спеціальних пермеазних систем, що здійснюють транспорт н-алканів із середовища в клітину. Проте клітина не байдужа до присутності н-алканів у середовищі. Дріжджові клітини, вирощені на них, мають деякі морфологічні відмінності від клітин, вирощених на глюкозі.
Крім транспорту, здійснюваного через канали в стінках, передбачається можливість надходження вуглеводнів у клітину дріжджів так названим молекулярно-дифузним шляхом. Відповідно до цієї теорії існує два етапи в поглинанні вуглеводнів. Первинний етап представляє собою пасивне, фізико-хімічне сорбційне поглинання й дифузійне пересування через всю клітинну оболонку до цитоплазматичної мембрани тільки через зовнішній шар клітинної оболонки. Другий етап - активне поглинання - обумовлене протіканням метаболічних реакцій, які зрушують сорбційну рівновагу й створюють відповідний сорбційний градієнт, що забезпечує безперервність надходження вуглеводню в клітини.
Найбільше детально вивчена ферментна система окислювання вуглеводнів в аеробних умовах у бактеріальних культур, що відносяться до Pseudomonas. Вона містить три білкові фракції, які становлять ланцюг переносу електронів, що нагадує дихальний ланцюг у системі окисного фосфорилювання. В якості донорів водню, що служать джерелами електронів, тут виступають НАД-Н. (можливо НАДФ-Н). Найпершим у ланцюзі компонентів являє собою фермент НАД-Н-рубредоксин-оксидоредуктаза (рубредоксин-над+-редуктаза), що відноситься до флавопротеїнів. Фермент відновлює окислений рубредоксин:
Рубредоксин являє собою низькомолекулярний залізовмісний білок У його. склад входять 1-2 атома заліза, пов'язаних із вхідними в молекулу залишками цистеїну. Окислювально-відновні реакції можуть здійснюватися внаслідок змінної валентності заліза. По своїх властивостях рубредоксин нагадує білок фередоксин з фотосинтезуючих організмів. Заключний етап здійснює фермент ω-гідроксилаза. Названо фермент так внаслідок своєї здатності гідроксилювати н-карбонові кислоти, отримані з жирів. Гідроксилаза приймає електрон від рубредоксину, передаючи його на субстрат:
9.2 Включення етанолу й ацетату в обмін речовин
Деякі технологічні труднощі, що виникають при культивуванні мікроорганізмів на н-алканах, привели до необхідності використовувати етанол в якості сировини.
Ці роботи привели до того, що були знайдені культури, що добре ростуть на етанолі або оцтовій кислоті. Виявилося можливим одержувати не тільки біомасу, але і деякі продукти ферментації, наприклад амінокислоти. Ацетат входить у середовища переважно у вигляді солі амонію. Початкові концентрації звичайно не перевищують 1- 2 %, однак по ходу культивування проводиться дробова добавка ацетату. Етанол також вводять у середовища в невисоких концентраціях і потім роблять дробові добавки. Як видно з наведеної нижче схеми, з етанолу утвориться ацетальдегід.
У ході реакцій окислювання етанолу утворяться дві молекули відновленої форми НАД, які можуть включатися в реакції синтезу.
9.3 Асиміляція метанолу
Крім оцтової кислоти й етанолу в якості можливого потенційного компонента середовища називають метанол. Перший етап включення метанолу в обмін речовин - утворення формальдегіду за рахунок метанолдегідрогенази - механізм її дії у деталях невідомий.
Відповідно до однієї з теорій, птеридиновий кофактор функціонує як акцептор електронів. Друга теорія припускає, що метильна група метанолу може зв'язуватися з N-атомом птеридинового кільця й окислятися до N 5,10-метиленового похідного птеридина при додаванні акцептора електронів. Можливо також, що метанол зв’язується з дигідроформою птеридина, утворюючі 5-мегилгідропохідні. У результаті наступних внутрішньо-молекулярних перебудов утворюється N 5,10-метилденітропохідні птеридина, що може потім реокислятися в дигідропохідні в присутності акцептора електронів. Отже, птеридин може діяти як аналог ФАД або ФМН у флавопротеїдних ферментах або становити частину молекули, подібної до фолевої кислоті, виступаючи в ролі переносника й акцептора електронів. Продукт окислювання метанолу - формальдегід надходить далі в біосинтетичні шляхи або окисляється до мурашиної кислоти. Відомі деякі ферменти, здатні окисляти формальдегід до форміату. Крім того, є циклічний шлях окислювання формальдегіду. Асимілювати метанол можуть не тільки бактерії, але й дріжджові культури.
Контрольні питання:
1. Охарактеризувати особливості засвоювання вуглеводнів мікроорганізмами
2. Розкрити особливості включення етанолу й ацетату в обмін речовин
3. Охарактеризувати особливості засвоювання метанолу мікроорганізмами
Тема 10. Основні принципи регуляції обміну речовин у мікроорганізмів.
10.1 Основні уявлення про механізм регуляції
У мікробних клітинах функціонують різні системи регуляції обміну речовин. Принципові розходження між ними полягають у наступному: за допомогою однієї з них відбувається регуляція синтезу ферментів, за допомогою іншої - регуляція їх активності. Посередниками в здійсненні цих механізмів є низькомолекулярні з'єднання, які або синтезуються клітиною, або надходять у клітину з навколишнього середовища.
Основні дані про механізми регуляція були отримані на мутантних штамах або в досвідах іn vіtro на моделях. Останні не завжди в стані відтворити умови, близькі до іn vіvo, наприклад, у більшості лабораторних досліджень використовують розведені водяні розчини ферментів. У таких дослідженнях звичайно молярність субстрату в мільйон раз вище, ніж у ферменту, тоді як стає усе більше очевидним, що концентрації ферментів, субстратів і молекул-регуляторів близькі для більшості метаболічних шляхів. Модельні системи також майже не ураховують фазовий стан системи, зміни кінетичних характеристик в умовах, що нагадує гелі, вплив концентраційних ефектів. Тому деякі наші подання, отримані в досвідах іn vіtro, не завжди можуть бути перенесені на живі організми.
Істотний вплив на метаболізм, як позитивне, так і негативне, можуть робити слабкі білок-білкові взаємодії. Для ферментів гліколізу, зокрема, можливо існування комплексу, що зазвичай, позитивно впливає на функції системи.
З іншого боку, реальна величина ферментативної активності в клітині може бути значно меншою, чим ніж дані, отримані іn vіtro. Відбувається це від тенденції багатьох внутрішньоклітинних ферментів до зв'язування з окремими клітинними структурами.
10.2 Індукція й репресія синтезу ферментних білків
Інформація про синтез ферментів, так само як й інших білків записана в геномі. Прийнято вважати, що клітина має два типи ферментів, що розрізняються по механізму регуляції їх синтезу: конститутивні й індуцибельні. Індуцибельні ферменти синтезуються клітиною у відповідь на вплив певного фактора зовнішнього середовища. Такими факторами зовнішнього середовища, як правило, буває який-небудь компонент середовища для культивування або середовища перебування. Наявність такої речовини в середовищі приводить до значного прискорення синтезу ферментів, відповідальних за його розщеплення й утилізацію. Така індукція відбувається в результаті посилення матричної активності відповідних генів, тобто, активування процесу.
Безпосередній акт індукції синтезу ферментів у клітині відбувається під дією некаталітичних алостеричних білків, які є продуктами певних регуляторних генів. Білки контролюють синтез ферментів негативно, тобто зв'язуються з бактеріальною хромосомою на якійсь ділянці поблизу структурних генів, що детермінують синтез цих ферментів, і перешкоджають їхній транскрипції. У відповідності зі сказаним вище не виникає, очевидно, труднощів у взаємодії внутрішньоклітинних субстратів катаболізму з регуляторною системою клітини прокаріотних організмів. Інакше стоїть справа з індукторами, що перебувають поза клітиною. Щоб індуктор проникнув у клітину, необхідно мати відповідну транспортну (пермеазну) систему. Відомо, що транспорт високомолекулярних поживних речовин у клітину із середовища обмежений, звичайно попередньо відбувається їхній ферментативний гідроліз. Ферменти, що здійснюють гідроліз, також здебільшого індуцибельні, тобто вимагають індуктора. У більшості випадків індуктори невідомі. Сигнал, що є присутнім поза клітиною, або повинен бути ензиматичним трансформований, щоб стати внутрішньоклітинним індуктором, або він є тільки першою ланкою сигналу, що викликає наростання або падіння концентрації індукторів у клітині. Під індуктором і репресором (разом позначаються як ефектор) варто розуміти речовини, які приводять до зміни швидкості синтезу білків при додаванні їх до культури (фізіологічні сигнали) При цьому, можливо, є регуляторним апаратом взаємодіє не сама додана речовина, а його метаболіт або навіть речовина іншого походження, концентрація якої підвищується в присутності доданої в середовище речовини. У більшості випадків як індуктори використовують субстрат дії ферменту.
У цей час система регуляції синтезу індуцибельних ферментів детально вивчена на прикладі β-галактозидази Е. colі. Сьогодні очевидно, що дана система у всіх деталях може розглядатися тільки для прокаріотних мікроорганізмів.
Гени, що детермінують структуру ферментів із близькими функціями, згруповані в бактеріальній хромосомі в одиничний оперон, що забезпечує можливість координованого контролю їхнього вираження відповідно до потреб клітин. До складу названого вище оперона Е. colі входять три гени.
Контрольні питання:
1. Охарактеризувати різновиди систем регуляції обміну речовин мікроорганізмів
2. Охарактеризувати принципи індукції й репресії синтезу ферментних білків