Метод фагового дисплею

Цей метод застосовується для вивчення взаємодії молекул, зокрема білок-білкових взаємодій, і виявлення ділянок, відповідальних за ці взаємодії. Він заснований на використанні бактеріофагів для співвідношення генів і кодованих ними білків. При цьому в оболонці фага опиняється (displayed) білкова молекула, інформація про яку міститься в рекомбінантній ДНК вірусу. Для цих цілей використовуються ниткоподібні фаги M13, fd і f1, які найкращим чином підходять для конструювання рекомбінантної ДНК. Наявність у фаговому геномі ділянки, яка неважлива для його життєдіяльності є найважливішою умовою для створення гібридних молекул ДНК. У фаговий геном вбудовують чужорідний ген, що кодує синтез певного білка або пептиду (селективного маркера), який після синтезу виявляється представленим в оболонці фага. Фаг що несе рекомбінантну ДНК, вбудовується в бактерійну молекулу (E.coli), де відбувається його розмноження (ампліфікація) [6].

Таким чином, створюються бібліотеки, що містять мільйони u1092 фагів кожний з яких містить в своєму капсиді унікальний білок (або пептид). Далі здійснюють процес, званий in vitro селекцією у якому проводять скринінг цих бібліотек шляхом взаємодії експонованих на поверхні фагів білків з визначеним імобілізованим лігандом.

Метод фагового дисплея забезпечує дослідження прямої залежності між фенотипом і генотипом, оскільки в оболонці фага виявляється експрес рвана молекула білка, інформація про структурі якої міститься в ДНК вірусу. Завдяки простоті і високій швидкості аналізу послідовності ДНК, метод фагового дисплея дозволяє здійснювати швидку ідентифікацію досліджуваних білків. Використовуючи подібну технологію рекомбінантних ДНК можна також створювати бібліотеки білків або пептидів.

Одним з підходів для оцінки білок-білкових взаємодій є використання фагових клонів, здатних специфічно взаємодіяти з поверхнею полістиролу і що несуть гени, які кодують афінні мітки, що істотно збільшують спорідненість до цієї поверхні . Як модельні системи використовуються мультиферментні комплекси або комплекс антиген- антитіло.

Наприклад, цистеїнсинтетазний мультиферментний комплекс у E.сoli містить два ферменти, а саме серинацетилтрансферазу(САТ) і О-ацетилсеринсульфгідролазу (ОАСС), які за умови достатньої концентрації сірки взаємодіють один з одним [8].

При цьому активність САТ зростає, а активність ОАСС падає що приводить до утворення О-ацетилсерину. Імобілізація на полістироловій поверхні гібридного ферменту ОАСС, отриманого або шляхом генетичного злиття або хімічного зшивання з пептидною міткою, збільшує інтенсивність сигналу, що оцінюється за допомогою імуноферментного аналізу, в порівнянні з сигналом, отриманим при імобілізації тільки ферменту. Більш того, коли мічений пептидами фермент заздалегідь взаємодіє з САТ в розчині з подальшою імобілізацією на полістироловій поверхні, інтенсивність сигналу ще більша збільшується завдяки взаємодії цих ферментів без будь-яких стеричних перешкод [6].

Методи мікроскопії

В даний час широко використовуються як для кількісної оцінки змін концентрацій і внутрішньоклітинної локалізації різних білків, так і для якісного вивчення білок-білкових взаємодій. Білкові комплекси утворені завдяки білок-білковим взаємодіям, можуть бути досліджені шляхом виявлення в клітинах областей білкових скупчень. Сучасні методи мікроскопії, такі як флуоресцентна мікроскопія і кріоелектронна томографія, дозволяють візуалізувати внутрішньоклітинні структури з роздільною здатністю до 4–5нм. Діаметр білкової глобули складає, в середньому, 3–5нм, а макромолекулярних комплексів – 10–100нм. Тому поєднання двох вищезгаданих методів дозволяє реконструювати макромолекули, їх комплекси і окремі внутрішньоклітинні структури в їх нативному стані. Поєднання методів мікроскопії з різними експериментальними підходами, а також з обчислювальними методами дає можливість не тільки в цілому представити внутрішньоклітинну структуру, але і створити повний і всеосяжний просторовий молекулярний атлас інтактної клітини. Так, створюваний у такий спосіб молекулярний атлас людини містить інформацію про набори генів і профілі експресії білків в різних нормальних і патологічних тканинах. У даному атласі білки класифіковані у відповідності з виконуваними функціями, а також по тканинах і біологічним рідинам, в яких вони виявляються. Для вивчення білок-білкових взаємодій застосовують такі методи флюоресцентної мікроскопії, як ферстеровське індуктивне резонансне перенесення енергії електронного збудження (FRET – fluorescence resonance energy transfer) і зображення по часу життя флуоресценції (FLIM – fluorescence lifetime imaging). Вони дозволяють здійснювати якісний аналіз білок-білкових взаємодій з вивченням як динаміки конформаційних змін, що відбуваються в білках, в просторі і в часі, так і амінокислотних послідовностей, що беруть участь у взаємодії. Флюоресцентна мікроскопія заснована на вимірюванні різних характеристик флюоресценції, таких як інтенсивність, час загасання, поляризація і довжина хвилі. Метод FRET заснований на вимірюванні кількості енергії, збудженої, що випускається молекулою флюорофора і переноситься на молекулу акцептора [1].

Поиск по сайту: