Методи, засновані на принципах системи подвійного гібрида

4. 2. 1. Система трьох гібридів

Для аналізу потрійних білкових комплексів і отримання генів, що кодують компоненти даних комплексів була розроблена система трьох гібридів. Система трьох гібридів заснована на принципах системи двох гібридів і використовується для дослідження випадків, коли перший білок безпосередньо не взаємодіє з другим білком і для здійснення даної взаємодії необхідний третій білок-посередник, а також у разі, коли третій білок зв'язується тільки з складеним сайтом, сформованим асоціацією першого і другого білків.

У разі пошуку третього білка, опосередковуючого взаємодію двох відомих білків, дані відомі білки синтезують в ре портерному штамі дріжджів в якості гібридних білків з ДНК-звязуючим і активуючими доменами GAL4. Бібліотеку послідовностей К-ДНК, використовувану для пошуку білка-посередника, клонують в спеціальний вектор. Цей вектор повинен містити ген-маркер живлення для відбору трансформантів, а також послідовність ядерної локалізації Т-антигена SV40, експресуючу у вигляді єдиного білка з послідовністю, кодованою К-ДНК.

Дріжджі трансформують вказаними плазмідами і визначають утворення потрійного комплексу за активацією експресії репортерних генів. Як репортерні гени використовують, як правило, lacZ і HIS3. З позитивних колоній дріжджів потім отримують послідовності К-ДНК, продукти експресії яких беруть участь в утворенні комплексу.

Система трьох гібридів розширює можливості системи двох гібридів. З її допомогою можна скрикувати К-ДНК бібліотеки для виявлення білків або пептидів, що порушують взаємодії двох відомих білків. У представленій системі можна також виявляти білки-регулятори, що модифікують взаємодії двох білків. Система трьох гібридів повинна полегшити вивчення механізмів білкових взаємодій в комплексних білкових системах, таких як, наприклад, система передачі сигналів [2, 9].

4. 2.2. Виявлення білок білкових взаємодій в клітинах тварин

Дуже часто в системі подвійних гібридів вивчають взаємодії білків, що походять з кліток тварин. З цим пов'язаний ряд проблем, оскільки білки кліток тварин, що продукуються в бактеріях або дріжджах, можуть бути нестабільними або можуть не мати вторинних модифікацій, необхідних для здійснення взаємодій [6].

У зв'язку з цим, було розроблено декілька підходів для дослідження білок білкових і ДНК-білкових взаємодій в клітинах тварин. Всі ці підходи засновані на загальних принципах, використовуваних в системі подвійних гібридів.

Одним з таких методів є метод кількісної реплікації (CRA). Метод заснований на реплікації плазмід, що містять к-ДНК, з бажаними властивостями. Реплікацію викликає великий Т-антиген вірусу SV40. Відбір таких плазмід проводять в спеціальних штамах Е. colі. Існують і новіші системи аналізу білкових взаємодій, такі як Sos-рекрутуюча система і аналіз за допомогою розділеного убіквітину(Split- ubiquitin assay) [8].

Метод кількісної реплікації

Метод заснований на трьох фактах: 1) Плазміни, що містять ori-послідовність вірусу SV40 можуть реплікуватися в пермісивних клітинах тільки коли в них нагромаджується Т-антиген SV40. 2) Оскільки в клітках ссавців аденілові залишки ДНК не метилюються, плазміни , чутливі до рестриктази Dpn I, отримані з Dam+ Е.coli (які мають GмATC послідовність), стають стійкими до Dpn I при реплікації в клітках ссавців. 3) ДНК-звязуючий домен дріжджового білка GAL4 з'єднуючись з активуючим доменом білка VP16 вірусу простого герпесу, може активувати транскрипцію з промоторів, що містять сайти приєднання GAL4 .

Для використання методу необхідно три плазміди. Перша плазміда служить джерелом Т-антигена. Вона містить мінімальний промотор, з якого утворюються незначні кількості Т-антигена за нормальних умов. Перед мінімальним промотором знаходиться п'ять тандемних сайтів для скріплення GAL4. Коли в клітках утворюється GAL4-VP16 гібридний білок, починається експресія Т-антигена, що викликає реплікацію плазмід, що містять оri-послідовність вірусу SV40. Друга плазміда містить промотор і енхансер SV40, а також ділянку, кодуючи ДНК-звязуючий домен білка GAL4. За послідовністю GAL4 знаходиться полілінкер для клонування фрагментів, що цікавлять, ДНК. З цієї плазміни синтезуються гібридні білки GAL4-X. Друга плазміда не містить оri-послідовність вірусу SV40. Третя плазміда містить оri-послідовність вірусу SV40, а також SV40-промотоp і енхансер, що викликають експресію активуючого домена білка VP16. Позаду кодуючої області VP16 знаходиться полілінкер для клонування бажаних послідовностей ДНК. Остання плазміда кодує гібридні білки VP16-Y. Всі три плазміни вирощують в Dam+E. coli, а також додатково обробляють Dam-метилазою in vitro, для повного метилування [5].

Взаємодія білків Х і Y відновлює цілісність гібридного фактора транскрипції GAL4-VP16. Чинник транскрипції взаємодіє з своєю операторною послідовністю, що знаходиться в першій плазміді, і запускає транскрипцію Т-антигена SV40. Експресія Т-антигена, у свою чергу, сприяє реплікації третьої плазміди. Внаслідок чого Dpn 1-чутливі сайти в третій плазміді перетворюються на Dpn 1-стійкі, і підвищується рівень продукції кодованого білка. Після виділення плазмід з клітин тварин, проводять розщеплювання цих плазмід по Dpn I. При рестрикції руйнуються плазміди, які містять метильовані сайти, тобто всі не репліковані плазміни. Бактерії трансформують рестрикційною сумішшю. Колонії бактерій, що утворюються при цьому, містять стійкі, тобто репліковані плазміди. Dpn I може також "різати" поліметильовані ДНК, тому в основному виділяють плазміди, що пройшли два і більш цикли реплікації в клітинах тварин.

Таким методом можна отримати принаймні, 100-кратне збільшення кількості ДНК, що кодує білок, що бере участь у взаємодії, з великого надлишку інших послідовностей ДНК. Отже, цей метод може бути цілком - застосовний при скринінгу К-ДНК бібліотек. Методом CRA можна досліджувати як білок -білкові, так і ДНК-білкові взаємодії в клітинах тварин. Припускають, що білки, які володіють слабкою неспецифічною аффінністю до ДНК не здатні сильно впливати на результати, отримані цим методом.

Представлений методичний підхід потенційно дуже чутливий, оскільки рівень експресії Т-антигена і подальша реплікація вектора підвищуватиметься із збільшенням кількості активуючого білка [8].

Основними обмеженнями в цьому методі є ступінь збагачення, який може бути отриманий при виконанні одного циклу CRA, і кількість клонів К-ДНК, що використовуються в одному циклі. Наявність значного числа неспецифічних клонів знижує ступінь збагачення специфічними плазмідами. У зв'язку з цим, рекомендують після першого циклу скринінгу розділити первинно позитивні клони на групи і досліджувати окремо кожну групу. Деякі з невірних результатів виникають за наявності нереплікованих плазмід, стійких до обробки Dpn I, навіть якщо вони містять декілька послідовностей G'"ATC. Триваліше метилування плазмід Dam-метилазою сприяє повному метилюванні і виникненню чутливості до Dpn I. Метилювання плазмідної ДНК Dam-метилазою перед трансфекцією в клітини культур тканини дозволяє значно понизити вірогідність виникнення фонових взаємодій.

Ці процедури підвищують ступінь очищення, отриманого при проведенні одного циклу CRA так, що, можливо, не виникне необхідність в проведенні повторних циклів або в скринінгу по групах, для виявлення потрібних К-ДНК. Даний метод також обмежений порівняно вузьким спектром типів клітин, достатньо пермісивних для реплікації SV40

Метод може широко застосовуватися при дослідженні різних білок -білкових і ДНК-білкових взаємодій, а також може бути використаний при скринінгу біологічних і фармакологічних реагентів, підсилюючих або блокуючих білок -білкові взаємодії; або для дослідження взаємодій між білками, залученими у формування макромолекулярних комплексів [6].

Метод визначення білок білкових взаємодій за допомогою розділеного убіквітину.

Даний метод виявлення білок - білкових взаємодій в клітинах еукаріот вперше був запропонований Джонсоном і Варшавським. Він заснований на тому ж принципі, що і класична система подвійного гібрида, тобто на запуску транскрипції ре портерного гена при успішній взаємодії білків, що цікавлять. Відомо, що убіквітин - консервативний білок з 76 амінокислот, зазвичай прикріплюваний до N- кінцю білків як сигнал деградації. Він може розщеплюватися убіквітин-специфічними протеазами (УСП), і це може бути детектовано за допомогою відщеплювання ре портерного білка, що зливається із З, - кінцем убіквітину. Ген, кодуючий убіквітин, розділяють на 2 частини: N- кінцеву частину, що кодує амінокислоти з 1 по 34 (Nub), і С-кінцеву частину, що кодує з 35 по 76 амінокислоти(Сub), і що зливається з геном ре портерного білка. N-частина дикого типу має високу спорідненість до С-частини, але заміна Ile-13 на Ala або Gly зменшує їх спонтанну взаємодію, роблячи його залежним від взаємодії білків, що зливаються з його частинами [6].

Таким чином, для аналізу білок-білкових взаємодій використовуються наступні гібридні частини молекули убіквітину: білок Х- Nub (Х- Nub) і білок Y- Сub -репортерний білок(Y- Сub - Rep). Як репортерний білок може бути використаний гібрид PLV, ДНК-звязуючий домен Lex A і домен VP16, що активує транскрипцію, що містить. PLV може активувати репортерні гени, зв'язуючись з LEX-A зв'язуючою ділянкою в промоторній області репортерних генів. Введення плазмід, що містять тільки фрагменти убіквітину не розпізнаються УСП і не викликають транскрипцію репортерних генів на значному рівні, як і плазмід, що містять тільки фрагменти або фрагменти, що зливаються з невзаємодіючими білками [8].

Взаємодія білків X і Y не обов'язково повинно відбуватися в ядрі, виявлення його можливо у разі цитоплазматичної локалізації взаємодій або у разі мембранної локалізації одного або обох білків. У такому вигляді ця система була випробувана на дріжджах Saccaromyces cerevisiae. У вектори, що містять фрагменти убіквітину, що зливаються з білками, що цікавлять, були введені гени стійкості до двох різних антибіотиків -зеотин і G418 (неоміцин) в Сub -кінцевій і Nub -кінцевій відповідно. Це забезпечувало селекцію клітин, що містять обидва вектори на середовищі з двома антибіотиками. Для експерименту була використана лінія людських фібробластів HT1080HPRT, дефіцитних по ферменту гіпоксантин-гуанін фосфорибозил трансфераза (HPRT). Ці клітини чутливі до середовища що містить гіпоксантин-аміноптерин-тимідин (HAT) і стійкі до середовища 6-тіогуанін(6TG). Були сконструйовані наступні вектори: білок Х зливається з Nub, білокY- з Сub,в якості репортерного був приєднаний ген гуанин-фосфорил-трансферази 2 (gpt2) з аргініном в 1-й позиції, який комплементує клітинну чутливість до середовища з додаванням HAT, але робить клітини чутливими до середовища, що містить (6TG). Як показано, існує N-кінцеве правило, згідно якому спостерігається кореляція між періодом напівжиття білка in vivo і його N- кінцевим амінокислотним залишком, причому залишок аргініну в такому положенні обумовлює швидку деградацію білка (44). Якщо білки X і Y взаємодіють, то відбувається розпізнавання фрагментів убіквітину, що зближують, убіквітин-специфічними протеазами і продукт гена gpt2 деградує згідно N-кінцевому правилу, а клітини набувають колишній фенотип, що дозволяє відібрати їх . Цей метод не заснований на транскрипції репортерних генів, тому підходить для дослідження взаємодій за участю транскрипційних факторів. У вектор, Nub, можна клонувати бібліотеку К-ДНК для здійснення скринінгу. Цим методом можна виявити ті взаємодії між білками ссавців, які не детектуються в клітинах дріжджів, оскільки залежать від модифікацій, що відбуваються тільки в тваринних клітинах [5].

Поиск по сайту: