В начале 1950-х гг. группа Александра Тодда заложила основы H-фосфонатного и фосфотриэфирного методов синтеза олигонуклеотидов. Реакция соединений 1 и 2 с образованием H-фосфонатного диэфира 3 является примером H-фосфонатной конденсации в растворе, в то время как реакция между 4 и 5 с образованием 6 — это фосфотриэфирная конденсация.
Схема H-фосфонатного олигонуклеотидного синтеза
Схема фосфодиэфирного синтеза
Схема фосфотриэфирного синтеза
Тридцать лет спустя эта работа вдохновила две исследовательские группы адаптировать H-фосфонатную конденсацию к твердофазному синтезу с использованием нуклеозидных H-фосфонатов в качестве строительных блоков, а пивалоилхлорида, 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорида (TIPS-Cl) и других соединений — в качестве активаторов. Практически метод был организован в виде очень простого синтетического цикла, состоящего из двух стадий: снятия диметокситритильной защиты и конденсации.Окисление H-фосфонатной диэфирной связи между нуклеозидами в фосфодиэфирные связи проводится после синтеза олигонуклеотидной цепи под действием раствора йода в водномпиридине. В случае необходимости, окисление может проводиться в безводных средах Метод также позволяет синтезировать тиофосфатные и селенофосфатные ]аналоги олигонуклеотидов. Окисление тетрахлорметаном в присутствии первичных и вторичных аминов приводит к фосфорамидатным аналогам. Ещё одним из удобств метода является возможность получения химерных олигонуклеотидов путем введения в их структуру двух или более типов производных межнуклеотидного фосфата.
Как правило, 5'-гидроксильная группа во всех 3'-Н-фосфонатах нуклеозидов и амино группа в Н-фосфонатах нуклеозидов c основаниями A, G и С защищаются перед использованием в синтезе теми же группами, что и в фосфорамидитном методе (см. ниже). Однако, защита амино групп не является строго обязательной.
Фосфодиэфирный метод
В 1950-х гг. Корана и сотрудники разработали фосфодиэфирный метод, в котором 3'-O-ацетилнуклеозид-5'-O-фосфат активировалсяN,N'-дициклогексилкарбодиимидом (DCC) или п-толуолсульфонилхлоридом (TsCl), а затем вводился в реакцию с 5'-O-защищённым нуклеозидом с образованием динуклеозидмонофосфата.[21] После удаления защитной ацетильной группы в основной среде, проводили дальнейшее удлинение цепи. Следуя данному методу, были синтезированы наборы три- и тетрадезоксирибонуклеотидов, которые затем были превращены в более длинные олигонуклеотиды, позволившие расшифровать генетический код. Главным ограничением фосфодиэфирного метода является образование пирофосфатных олигомеров и олигонуклеотидов, разветвлённых у межнуклеозидной фосфатной группы. Метод кажется шагом назад по сравнению с описанным ранее более селективным подходом, однако большинство доступных сегодня защитных групп фосфата в то время ещё не было открыто. Отсутствие удобной стратегии защиты потребовала отказа от данного метода для достижения цели исследования.
Фосфотриэфирный метод
В 1960-х гг. группы под руководством Р. Летсингера (R. Letsinger)и К. Риза (C. Reese)] разработали фосфотриэфирный метод. Определяющее отличие от фосфодиэфирного подхода состоит в предварительной защите фосфата в реагенте и продукте цианэтильной группой. Это изменение исключило возможность образования олигонуклеотидов с разветвлением у фосфатных групп. Бо́льшая селективность метода позволила использовать более реакционноспособные конденсирующие реагенты и катализаторы,[24][25] которые значительно уменьшили продолжительность синтеза. Метод, изначально разработанный для синтеза в растворе, был также применен и в твердофазном синтезе, первоначально на полистироле с низкой степенью сшивки, что инициировало широкий научный поиск в твердофазном синтезе олигонуклеотидов и в конечном итоге привело к автоматизации синтеза.