Использование колхицина для получения полиплоидов

Хотя самые первые опыты по воздействию колхицина на растения принадлежат Ч. Дарвину (Бреславец, 1963, стр. 19), направленное и результативное применение колхицина для индуцирования полиплоидов принадлежит Блекси и Эйвери (1937).

Колхицин относится к алкалоидам растительного происхождения и добывается главным образом из частей растения безвременник осенний (Colchicum autumnale L.), преимущественно из семян и клубнелуковиц. Как было установлено, колхицин содержится у представителей вех видов рода безвременник, которые произрастают и на территории России. Кроме того, он обнаружен у представителей некоторых других родов растений.

Колхицин сильнодействующее ядовитое вещество, обладающее выраженным избирательным действие на кариокинез в клетках эмбриональных тканей животных и растений. Вместе с тем он может вызывать разрушающее действие на клетки, особенно клетки опухоли. Как химическое вещество колхицин обладает большой стойкостью и не разлагается ни при долгом стоянии, ни при стерилизации в автоклаве. Однако под действием солнечного света он может разлагаться. Колхицин растворим в холодной воде, спирте, хлороформе.

Методика обработки растений колхицином основана на следующем.

1. Колхицин в водном растворе диффундирует в растительные ткани.

2. Полиплоидия возникает только в тканях с активным делением клеток: образовательных тканей – меристематических тканей и каллюса.

3. Действие колхицина проявляется в наибольшей степени при создании оптимальных условий для выращивания обработанного материала, что особенно важно в случаях, когда полиплоидия индуцируется у семян.

4. Оптимальная продолжительность (экспозиция) воздействия колхицином для разных видов неодинакова и в значительной степени зависит от продолжительности периода клеточного деления в определенной ткани.

5. Оптимальная концентрация колхицина для обработки различных объектов неодинакова.

В практической селекции, если заранее не известны оптимальные концентрации колхицина и экспозиции обработки, полезно предварительно установить эти параметры эмпирически. Последнее может быть осуществлено на основе знаний о продолжительности периода деления клеток соответствующих тканей у обрабатываемого растения и о времени, необходимом для проникновения препарата в требуемые ткани (Бреславец, 1963, стр. 33).

При работе с деревьями и кустарниками могут быть использованы следующие рекомендации.

Форма применения колхицина – водный раствор, или реже для специальных целей водный раствор колхицина в агар-агаре, ланолиновая паста с колхицином.

Концентрация действующего препарата: наиболее часто применяются водные растворы колхицина в концентрации от 0,1 % до 1,0 % (Котов, 1997, стр. 176), и до 1,6 % (Бреславец, 1963, стр. 33).

Объекты обработки: прорастающие и не прорастающие семена, проростки и всходы, распускающиеся цветочные почки, растущие листья и хвоя, точки роста корней и ветвей, нарезанные зеленые и одревесневшие черенки перед укоренением, срезанные ветви при искусственном опылении на срезанных ветвях, сеянцы и саженцы при их контейнерном выращивании в теплицах, свободно растущие деревья и кустарники.

Экспозиция обработки – от нескольких часов до нескольких суток и даже до двух недель (Котов, 1997, стр. 176).

Обработка семян состоит в их замачивании в водных растворах, как правило, низких (0,1 – 0,2 %) концентрациях в экспозиции 12 – 24 (и до 48) часов. Обработку проводят в чашках Петри или раскладывают семена на фильтровальную бумагу, смоченную раствором. Во всех схемах обработки, по её завершении рекомендуется семена промыть в дистиллированной воде, подсушить и высеять.

Обработка проростков и всходов предусматривает воздействие на точки роста развивающегося побега. Согласно одной из методик (Томпсон и Козар, по Бреславец, 1963, стр. 35), семена первоначально раскладывают в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу без реагентов и выдерживают в темноте, до того момента, пока не появятся проростки побегов, а корни – не прикрепятся к бумаге. После этого кружки фильтровальной бумаги извлекают из чашек и опрокидывают на другие чашки Петри несколько меньшего диаметра заполненные раствором колхицина. При этом размещают их так, чтобы сами кружки только покрывали чашки сверху, корни оставались бы вне зоны обработки, в раствор погружались бы только верхушечные части проростков. Существуют рекомендации (Джиорфи, 1938, по Бреславец, 1963. стр. 35), по которым растущие кончики проростков окутывали ватой, смоченной раствором колхицина. Одним из вариантов является обработка проростков водным раствором колхицина нанесением его на точку роста между семядолями при помощи пипетки (Шванитц, по Бреславец, 1963, стр.36).

Обработка листьев и хвои наиболее результативна в период их роста при воздействии на растущие зоны (периферия листа и основание хвои). Перспективным может оказаться вариант с обработкой листьев при их укоренении как листовых черенков: они могут дать начало полиплоидным растениям.

Обработка растущих побегов и почек предусматривает нанесение капельного раствора или его втирание на кончики растущих побегов и распускающихся почек. Обработку можно повторить дважды. Допустимо погружение верхушек побегов в водный раствор на время от несколько часов до 1 – 2 суток. Для обеспечения точного воздействия колхицина только на точки роста препарат можно наносить на обрабатываемую поверхность в форме ланолиновой пасты с концентрацией 0,5 – 1,0 % или в форме водного раствора (1 часть 2 % раствора) на агаровой основе (1 часть 3% агар-агара). Для тех же целей применяют эмульсии, содержащие колхицин, на основе смеси, состоящей из глицерина, воды и эмульгирующих инертных веществ либо из глицерина, спирта и эмульгаторов. Эмульсии наносят на точки роста по 3 – 8 капель пипеткой или маленькой кисточкой. Самым экономичным при высокой эффективности считают метод нанесения капли раствора непосредственно на почку в течение целого дня или нескольких дней, повторяя операцию по мере высыхания капли. Известен метод опрыскивания водным раствором побегов.

Обработка молодых растений в контейнерной культуре позволяет применить опрыскивание, как целого растения, так и его части. Метод положителен тем, что позволяет получить полиплоидную ткань в любой части растения. Кроме того, для обработки сеянцев и саженцев, выращиваемых в контейнерах в условиях теплиц, применимы описанные выше методы обработки листьев, побегов, почек.

Обработка черенков предусматривает их предпосадочное помещение нижними срезами в водный раствор колхицина; глубина погружения при этом составляет 1 – 2 см, экспозиция обработки от 12 до 24 часов. После обработки рекомендуется нижние части черенков, которые были погружены в раствор, удалить, после чего черенки высаживаются на укоренение. Целесообразно сочетать указанную обработку с обработкой стимуляторами регенерационных процессов.

Обработка срезанных ветвей, предназначенных для гибридизации, аналогична обработке черенков. После обработки и удаления нижних частей ветви устанавливают в емкости с водой или питательным раствором.

Обработка свободно растущих деревьев и кустарников возможна посредством инъекций в ствол вегетирующего растения. Проводится весной в период активного сокодвижения. Для этого в нижней части ствола сверлят отверстие примерно на глубину половины радиуса ствола, в образовавшееся отверстие вводят плотно входящую перфорированную трубку из неокисляющегося материала. Её соединяют через резиновый шланг с резервуаром, содержащим водный раствор колхицина. Раствор колхицина разносится по всему растению восходящим током и достигает точек роста и почек, где вызывает аномалии в делении клеток и возникновение полиплоидных соматических клеток и нередуцированных гамет. Для обработки свободно растущих деревьев и кустарников (доступных их частей) приемлемы и описанные выше методы обработки побегов, почек, листьев и хвои.

Получение гаплоидов

Гаплоиды – это особи обычно диплоидных или аллополиплоидных видов, в соматических клетках которых содержится гаплоидный – одинарный – набор хромосом (В.П.) в 2 раза меньше хромосом, чем у исходных форм, причем из каждой пары гомологичных хромосом представлена только одна хромосома (Гужов и др., 1991, стр. 265).

В селекции растений гаплоидия как явление и гаплоиды как объекты приобретает все большее значение. Получение и использование гаплоидных растений позволяет решать целый ряд теоретических и практических задач.

Изучение гаплоидов и гаплоидии у высших растений позволяет определять геномный состав видов и уточнять их таксономическое положение, определять дозу геномов в полиплоидных рядах, выяснять происхождение и генетические причины апомиксиса, объяснять направления и пути эволюции.

Гаплоиды образуются естественным путем и могут быть получены искусственно. Вместе с тем отмечается, что естественные гаплоиды крайне редки. Информации о гапдоидии у древесных видов крайне мало. По кукурузе имеются сведения, что 1 гаплоид можно выделить из 1000 сеянцев, полученных из семян, возникших в результате апомиксиса.

На явлении гаплоидии основаны методы получения из гаплоидов путем индуцированного удвоения числа хромосом гомозиготных диплоидных линий. В комбинационной селекции такой подход обеспечивает получение наиболее удачных рекомбинаций генов. Считается (Гужов и др., 1991, стр. 266), что эффективность комбинационной селекции может возрастать в сотни раз, если будут разработаны способы массового выделения гаплоидов для последующего перевода их на диплоидный уровень.

В селекции сельскохозяйственных культур применение метода гоплоидии дало положительный результат при работе с табаком, рапсом и некоторыми другими культурами. Заметные положительные результаты в селекции гаплоидов древесных растений пока не достигнуты.

Путем удвоения числа хромосом у гаплоидов можно сразу (за одно поколение) создать гомозиготные линии. При селекции на гетерозис у перекрестно опыляемых культур на создание чистых линий требуется получение 7 – 10 поколений, что для древесных видов, чрезвычайно долго. Теоретически селекция гаплоидов при работе с древесными видами позволит получить чистые линии, способные обеспечить полную передачу признаков потомству при самоопылении. То есть теоретически можно обеспечить создание посадочного материала семенного происхождения, но с отселектированными признаками.

Гаплоидные особи образуются вследствие самопроизвольного деления неоплодотворенной яйцеклетки. И хотя подобные явления в природе достаточно редки, гаплоидные формы обнаружены как у голосеменных, так и у покрытосеменных растений. Чаще всего гаплоидные формы древесных пород нежизнеспособны и погибают на ранних стадиях своего развития. Этим объясняется в известной степени тот факт, что они редко встречаются в природных популяциях. По той же причине гаплоиды находят ограниченное применение и в селекции древесных и кустарниковых видов растений.

Получение гаплоидных особей может быть достигнуто стимулированием деления неоплодотворенной яйцеклетки. Это может быть вызвано опылением пыльцой, у которой спермии заранее убиты воздействием высокой температуры, рентгеновскими лучами или химическими реагентами (тулоидином сини). В итоге из большого числа осуществленных опылений получают единичные гаплоиды.

Второй путь – это получение гаплоидов с помощью культуры тканей. Например, вызывают активный рост и последующую дифференциацию тканей жизнеспособной пыльцы или яйцеклеток, неоплодотворенных, или «оплодотворенных» убитой пыльцой. Возможность получения гаплоидов, в частности тополей и карельской березы, подтверждена современными (2002 год) работами российских ученых из НИИ лесной генетики и селекции (Лесоводственная информация, № 6, 2002, стр. 40).

Поиск по сайту: