Определение активности супероксиддисмутазы (СОД)

Fried R. Enzymatic & non-enzymatic assay of superoxidedismutase // Biochem.-1975.-57, №5.-P.657-660

Черемисина З.П., Суслова Т.Б., Коркина Л.Г. Хемилюминесцентное определение активности супероксиддисмутазы // Клинич. лаб. диагностика – 1994 - № 1 – С.22-23

ПРИНЦИП МЕТОДА. Активность определяли комбинацией методов (Fried, 1975 и Черемисина и др., 1994). Определение основано на способности СОД ингибировать восста­новление нитросинего тетразолия НСТ (Fried, 1975) в условиях генерации О₂^-., которая осуществляется при окислении адреналина в адренохром при участии О₂ (Черемисина и др., 1994).

Реактивы

50 мМ Na-CO₃ – буфер рН 10,2: 50 мМ Na₂CO₃ 5,3 г Na₂CO₃ (или 14,3 г Na₂CO₃ ×10 Н₂О) в 1 л дис-воды, довести рН HCl конц. (~1-1,3 мл)

нитросиний тетразолий НТС: 0,5 мг/мл дис-воды, стабилен min неделю

0,1% адреналин (аптечный)

3% HCl

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

50 мкл биоS

+ 0,2 мл НТС

+ 3,5 мл буфера СОД

+ 50 мкл адреналина (пуск)

водяная баня 5 мин 37^оС

+ 0,1 мл 3% HCl (stop)

ФЭК λ = 540 нм

Холостая проба: не приливать биоS, обработать так же, как опытную. Dхп должная быть ~ 0,700

Активность фермента выражали в условных единицах на мг белка в минуту [у.е. / мг белка × мин]. За у.е. активности фермента принимали 50 % ингибирование скорости восстановления НТС.

СОД [у.е. / мг ОБ ×мин] = , где

Dхп и Dоп – оптическая плотность холостой и опытной пробы

С – концентрация белка в биоS, мг/мл

Vs – объем биосубстрата, мл

t – время инкубации, мин

Определение в гемолизате эритроцитов и цельной крови.

Поскольку гемоглобин мешает определению (он поглащает при той же λ), его нужно удалить из пробы.

Осаждение Hb

Реактив: смесь этанол – хлороформ (5:3 v:v), ледяная, хранить в морозилке

Процедура. 1 мл гемолизата (или 0,1 мл цельной крови + 0,9 мл дис-воды)

+ 0,4 мл ледяной смеси ЭХ

интесивно перемешать, холодильник 30 мин, центрифуга 10 мин 3000 об.

Определять активность в прозрачном слегка желтоватом надосадке по стандартной прописи. При расчете активность пересчитывать не на белок, а на Hb.

Определение активности каталазы (Кат)

Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело.-1988.-№1.-С.16-19.

ПРИНЦИП МЕТОДА. Неразложившаяся перекись водорода образует с молибдатом аммония комплекс желтого цвета. Оптическая плотность образца обратно пропорциональна активности фермента.

РЕАКТИВЫ

0,03% Н₂О₂ : аптечную 3% перекись развести в 100 раз дис-водой

4% молибдат аммония : 40 г молибдата (NH₄)₆Мо₇0₂₄×4Н₂О в 1 л дис-воды.

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

Биосубстрат (0.02 мл плазмы, гемолизата эритроцитов и гомогената печени)

+ 2 мл Н₂О₂ (пуск)

водяная баня 10 мин +37°С.

+ 1 мл молибдата (stop)

ФЭК l = 410 нм

Холостая проба: биоS прилить после молибдата (т.е. Н₂О₂ + молибдат → 10 мин + биоS)

Можно ставить контрольную пробу на Н₂О₂ : биоS не добавлять, определять по стандартной методике

Активность каталазы рассчитывали, исходя из e₀ = 22,2×10³ мМ^-1см^-1 и выражали в [МЕ / мг белка].

Определение физико-химических и структурных свойств мембран эритроцитов

Физико-химические характеристики мембран эритроцитов определяли флюорометрическим способом с применением зондов. Методы основаны на изменении интенсивности флюоресценции зондов в зависимости от свойств мембран

Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флюоресцентные зонды в исследовании биологических мембран.-М.: Наука.-1980.-320 с.

Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов.-М., Наука.-1989.-276 с

Работа с пиреном

С применением гидрофобного зонда пирена изучали 4 параметра мембран эритроцитов: погруженность белков в липидный бислой (DF), микро­вязкость зон белок-липидных контактов (F₂₈₆), микровязкость липидного бислоя (F₃₃₄) и полярность микроокружения липидов (F_372/393). Определение погруженности белков в липидный бислой основано на уменьшении флюо­ресценции, обусловленном безызлучательным переносом энергии с пирена на ароматические аминокислоты в составе мембранных белков. Определение микровязкости (F₂₈₆ и F₃₃₄) основано на изменении степени эксимеризации молекул пирена в зависимости от свойств липидного бислоя. Эксимерная и мономерная формы пирена имеют собственные l_эмисс.

РЕАКТИВЫ

Биосубстрат (суспензия клеток) выверен по белку: 0,1 мг/мл (100 γ/мл)

1мМ пирен = 4 мг пирена в 20 мл этанола

вносимый в пробу объем пирена определить титрованием экспериментально: необходима точка (концентрация пирена) перед выходом кривой флюоресценции на плато.

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

1 мл суспензии эритроцитов инкубировали 15 секунд на магнитной мешалке,

флюориметр l_{возбуждения}=286 нм и l_{эмиссии}=330 нм (нативная флюоресценция мембран, F⁰).

Вернуть в бюкс всю пробу

+ 5 мкл пирена.

Инкубировать пробу на мешалке 45 секунд и измеряли флюоресцен­цию при различных длинах волн:

l_возб = 286 нм, l_эмисс = 330 нм - F^/

l_возб = 286 нм, l_эмисс = 470 нм - F_{э 286}

l_возб = 286 нм, l_эмисс = 395 нм - F_{м 286}

l_возб = 334 нм, l_эмисс = 470 нм - F_{э 334}

l_возб = 334 нм, l_эмисс = 395 нм - F_{м 334}

l_возб = 334 нм, l_эмисс = 372 нм - F₃₇₂

l_возб = 334 нм, l_эмисс = 393 нм - F ₃₉₃

Погруженность белков в липидный бислой D F = F⁰ - F^/

Микровязкость зон белок-липидных контактов F₂₈₆ = F_{э 286} / F_{м 286}

Микровязкость липидного бислоя F₃₃₄ = F_{э 334} / F_{м 334}

Полярность микроокружения липидов F_372/393= F₃₇₂ / F₃₉₃

Работа с АНС

Используя зонд 1-анилинонафталин-8-сульфат (1,8-АНС) (АНС), иссле­довали поверхностный заряд мембран эритроцитов. Метод основан на из­мерении флюоресценции проб в присутствии АНС. Усиление флюоресцен­ции после введения АНС обусловлено излучением связанной с положительно заряженными группами на по­верхности мембраны формы зонда; вклад свободного АНС во флюорес­ценцию проб пренебрежимо мал. Отрицательный заряд мембран и интенсивность флюоресценции связаны обратнопропорциональной зависимостью.

РЕАКТИВЫ

Биосубстрат (суспензия клеток) выверен по белку: 0,1 мг/мл (100 γ/мл)

1 мМ АНС : 3,1 мг АНС в 10 мл дис-воды

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

1 мл суспензии эритроцитов инкубировали 15 секунд на магнитной мешалке

флюориметр l_возб = 360 нм и l_эмисс = 480 нм (нативная флюоресценция мембран, точка 0 мкл АНС).

Вернуть в бюкс всю пробу

+ 20 мкл АНС.

Инкубировать пробу на мешалке 1 мин и измерить F при тех же длинах волн (точка 20 мкл АНС).

Контрольные и опытные про­бы сравнивали между собой отдельно по обеим точкам.

Поиск по сайту: