Вещества с особенно длительным послесвечением называются фосфорами

Чаще переход электронов на основной уровень S₀ начинается с промежуточных переходов с верхних возбуждённых уровней на нижележащие возбуждённые уровни ( ; ; → → ). Энергия этих переходов мала и сразу превращается в тепловую энергию тела. Переходы, которые сопровождаются превращением энергии в тепло, называются безызлучательными (переходы 5, рис.5). Эти процессы совершаются очень быстро – за 10^-13 ÷ 10^-12 с. Следующий этап, переход электрона с возбуждённого уровня на уровень S₀. Он сопровождается высвечиванием фотона с энергией меньшей, чем энергия фотона, вызвавшего эту спонтанную флуоресценцию: hν_изл = hν_пгл – Е_тепл ( правило Стокса, кривые В, рис.5).

Отметим, что энергия возбуждённой молекулы может передаваться другой молекуле (миграция энергии), в этом случае переход в основное состояние не сопровождается люминесценцией.

Свечение у тирозина наблюдается и после выключения света. Это объясняется наличием у него метастабильного энергетического уровня Т. Этот уровень соответствует триплетному состоянию внешней электронной оболочки молекулы, на которой находиться два неспаренных электрона. Их суммарный спиновый момент принимает одно из трёх значений: +1; 0; -1, поэтому данное состояние и называется триплетным. При переходе на уровень Т, спин электрона меняется на противоположный, в результате чего два электрона внешней электронной оболочки становятся не спаренными. Молекула превращается в бирадикал. Такие молекулы обладают высокой химической активностью и могут терять энергию возбуждения вступая в химическое взаимодействие с другими молекулами.

Уровень Т расположен несколько ниже уровня . Его называют запрещённым, так как сюда электрон не может перейти с основного уровня S₀. Однако, возможны переходы электронов на уровень Т с вышележащих уровней ( , , ). Понятно, что таким переходам предшествуют безызлучательные переходы ( ; , ). Продолжительность жизни молекулы в триплетном состоянии от 10^-3 до нескольких секунд, т.к. прямой спонтанный переход электрона с уровня Т на основной уровень S₀ невозможен. Это связано с тем, что ориентация спинов электронов на Т и S₀ уровнях одинакова. Правила запрета такие переходы не разрешают. Люминесценция, которая возникает при переходе электронов с Т на S₀ уровень, называется фосфоресценцией (переход 4, рис.5).

Как видно из рассмотренного примера, спектры люминесцентного излучения будут определяться структурой энергетических уровней вещества и будут иметь для каждого вещества свой характерный вид. . Это означает, что спектры фотолюминесценции можно использовать при определении природы и химического состава вещества.

Этот метод называется люминесцентным анализом. Его подразделяют на два вида: макроанализ, когда наблюдение за излучением ведут невооруженным глазом и микроанализ, когда спектры излучения исследуются с помощью спектральных приборов.

Макроанализ применяется при проверке качества и сортировке пищевых продуктов, например, для обнаружения начальной стадии порчи пищевых продуктов. В частности, свежая рыба не люминесцирует, слегка подпорченная – испускает голубое свечение, а сильно испорченная – желтое и красное.

Люминесцентный анализ применяется и при диагностике заболеваний, особенно кожных (дерматомикозы животных) и других болезней. Так поражённые грибком волосы и чешуйки кожи, освещённые ультрафиолетом дают ярко-зелёное люминесцентное свечение. Во многих случаях в качестве диагностического приёма пользуются введением в организм люминесцентных красок, которые адсорбируются в тех или иных тканях. Эти ткани затем исследуют под действием УФ-излучения. Например, в вену человека вводят раствор флюоресцина и, спустя некоторое время, наблюдают яркую зелёную люминесценцию губ и глаз. Этим методом определяется циркуляция крови в области тела с пониженным кровообращением.

Вообще, под воздействием УФИ характерную флуоресценцию имеют многие биоткани (ногти, зубы, хрусталик и роговая оболочка глаза, опухоли и т. д.) и биоорганизмы (бактериальные и грибковые колонии, светлячки и др.). По цвету свечения различают живые и мёртвые клетки. Наличие адреналина в крови человека определяется по его характерному зелёно-жёлтому свечению.

В фармации макроанализ используют при сортировке лекарственных препаратов и проверке качества фармакологических средств, для обнаружения в них суррогатов или фальсификаций. Бόльшая часть органических соединений (кислоты, алкалоиды, красители) даёт при поглощении УФ-излучения характерное свечение. Например, никотин даёт темно-фиолетовое. Люминесцентный анализ используется для контроля за чистотой реактивов и воды.

На рис.6 показана схема флуоресцентного макроанализа. Ультрафиолетовое излучение от ртутной лампы (РЛ) направляется на объект (ОБ) и возбуждает его люминесценцию. Свет люминесценции поступает в приёмник (ПР) – глаз, фотоэлемент, фотопластинка, фотоумножитель, где регистрируется. Чтобы видимый свет источника не накладывался на свет люминесценции, применяют светофильтр СФ, пропускающий к объекту только невидимые глазом ультрафиолетовые лучи.

При микроанализе регистрируются такие основные параметры люминесценции как: спектр излучения; спектр возбуждения; энергетический выход; время жизни молекул в возбужденном состоянии; степень поляризации люминесцентного излучения. Параметры флуоресценции чувствительны к окружению флуоресцирующих молекул. Это позволяет по люминесцентному излучению судить о межмолекулярном взаимодействии, о химических превращениях, о микровязкости и фазовых переходах в клеточных мембранах и о других процессах протекающих в биосистемах.

В последнее время в практике научных исследований, широкое применение нашли методы флуоресцентных зондов и меток – искусственного внедрение флуоресцирующих молекул в белки и мембраны клеток, которые сами по себе не люминесцируют. Зонд – это молекула, которая удерживается в исследуемом соединении электростатическими или гидрофобными силами. Метка – флуоресцирующая молекула, замещающая какой-то фрагмент соединения и образующая ковалентные связи с другими соседними группами данной сложной молекулы.

Изменение флуоресценции зондов и меток позволяет обнаружить конформационные перестройки в белках и мембранах. Метод люминесцентных меток используют для обнаружения в пробах наркотиков и витаминов С, Д, В, В₂, а так же других веществ, не обладающих собственной флуоресценцией.

Проводят микроанализ с помощью специальных люминесцентных микроскопов и спектрофлуориметров.

Установка для люминесцентной микроскопии (рис.7) состоит из ртутной лампы О, светофильтра Ф, пропускающего только ультрафиолетовое излучение, теплового фильтра Т, кварцевой призмы П, и конденсора К с кварцевыми линзами. Исследуемый препарат располагается на кварцевом или увиолевом предметном стекле. Оптическая часть микроскопа выполнена из обычного стекла, т.к. через неё проходит видимый свет, возникший в результате флуоресценции. Люминесцентная микроскопия используется при изучении флуоресцирующих естественных препаратов или окрашенных флуоресцирующей краской.

Оптическая схема спектрофлуориметра представлена на рисунке 8:

Люминесцентный анализ чувствителен, не требует разделения смеси, его можно проводить для биологических сред, тканей и других многокомпонентных систем. Отличительной чертой люминесцентного анализа является возможность обнаружить наличие ничтожно малого количества вещества до 10^-9 г. Следует отметить, что люминесцентным методом легко обнаруживаются соединения, для которых квантовый выход люминесценции больше 1%. Высоким квантовым выходом обладает триптофан в белках, витамин А, В₆, Е, многие лекарственные вещества. Легко обнаруживаются люминесцентным методом канцерогенные углеводороды в воздухе городов, дыме сигарет и т.д.