1. Проделать лабораторную работу "Определение остаточного азота и билирубина в сыворотке крови".
2. Сделать выводы по результатам проведенных опытов. Оформить результаты опытов.
3. Подготовиться к защите лабораторной работы и решению задач (ориентировочные задачи и вопросы приведены ниже).
Лабораторная работа
I. Определение остаточного азота в сыворотке крови.
Оборудование:
1.
Штатив с пробирками.
2.
Пипетки на 0,1мл,1 мл и 5 мл.
3.
Колба на 50 или 100 мл.
4.
Центрифуга.
5.
Центрифужные пробирки.
Реактивы:
1.
Реактив А.
2.
Реактив В.
3.
КI кристаллический.
4.
НСl
5.
1% раствор крахмала
6.
Сыворотка.
7.
Дистиллированная вода.
8.
0,005 Н раствор тиосульфата натрия.
Принцип метода. Остаточный азот – это небелковый азот биологических жидкостей. Гипобромитный метод его определения основан на свойстве гипобромита разрушаться при взаимодействие с азотистыми веществами безбелкового центрифугата. Остаток непрореагировавшего гипобромита определяют йодометрически – титрованием тиосульфатом натрия. Для расчета количества остаточного азота определяют количество разрушенного гипобромита, как разность между титром контрольной пробы (не содержащей остаточного азота) и опытной пробы (с остаточным азотом).
Ход работы. Для осаждения белков в пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды, 0,1 мл сыворотки и 4,0 мл осаждающего реактива. Через 10 мин смесь центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. За это время готовят рабочий раствор гипобромита, смешивая 9 частей реактива А и 1 часть реактива В. В колбу для титрования отбирают 4 мл центрифугата, добавляют 5 мл рабочего раствора гипобромита, перемешивают и оставляют на 1-2 мин. Затем добавляют несколько кристалликов КI, 3 мл раствора НСl, смесь взбалтывают и титруют 0,005Н раствором тиосульфата до слабо-желтого цвета. Добавляют 2-3 капли раствора крахмала и дотитровывают до обесцвечивания. Одновременно с опытной готовят контрольную пробу, содержащую 4 мл осаждающего реактива, 5 мл рабочего раствора гипобромита, несколько кристалликов KI и 3 мл раствора HCI. Контрольную пробу титруют также до обесцвечивания.
Содержание остаточного азота рассчитывают по формуле:
(К - О) х 21,4 = ммоль/л, где К – количество тиосульфата, пошедшего на титрование контрольной пробы, О – на титрование опытной пробы, 21,4- коэффициент пересчета.
Нормальное содержание остаточного азота – 14,3 - 28,6 ммоль/л.
Диагностическое значение определения остаточного азота
Ретенционная (связанная с выведением) почечная гиперазотемия наблюдается при различных заболеваниях почек. Ретенционная непочечная гиперазотемия наблюдается при недостаточности кровообращения, травматическом шоке, опухолях мочевого пузыря.
Продукционная гиперазотемия сопровождается процессом усиления распада белка - при туберкулезе, диабете, тяжелом циррозе печени, при инфекционных заболеваниях, сопровождающихся лихорадкой. Понижение остаточного азота наблюдается при недостаточном питании, иногда – при беременности.
2. Определение билирубина в сыворотке крови.
Оборудование:
1.
Штатив с пробирками.
2.
Пипетки на 1 мл и 2 мл.
3.
КФК.
4.
Кюветы на 0,5 см.
Реактивы:
1.
Кофеиновый реактив.
2.
0,85% раствор NaCl.
3.
Диазореактив.
4.
Сыворотка крови.
Принцип метода. Связанный билирубин при взаимодействии с диазореактивом (диазофенилсульфоновая кислота) образует розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. Кофеиновый реактив переводит свободный билирубин в растворимое состояние, благодаря чему он также реагирует с диазореактивом, образуя розовое окрашивание. По интенсивности этого суммарного окрашивания определяют концентрацию общего билирубина. А концентрацию свободного билирубина определяют как разность между общим и связанным билирубином.
Ход работы. В 3 пробирки приливают реактивы по схеме:
Реактивы (мл)
Общий билирубин
Связанный билирубин
Контрольная проба
Сыворотка
0,5
0,5
0,5
Кофеиновый реактив
1,75
----
1,75
0,85% раствор NaCl
----
1,75
0,25
Диазореактив
0,25
0,25
----
Через 5-10 мин после прибавления диазореактива колориметрируют пробу на связанный билирубин (при более длительном стоянии пробы в реакцию вступает несвязанный билирубин, что искажает результат). Пробу на общий билирубин колориметрируют через 20 мин после добавления диазореактива. Колориметрирование проводят при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против контроля. Концентрацию общего и связанного билирубина определяют по калибровочному графику.
Нормальное содержание билирубина в сыворотке: общий – 1,7-20,5 мкмоль/л, связанный – 0,86-4,3 мкмоль/л, свободный – 1,7-17,1 мкмоль/л.
Диагностическое значение определения билирубина сыворотки крови
Причины, вызывающие гипербилирубинемию, различны. Желтуха появляется, когда уровень билирубина в крови превышает 43 мкмоль/л. Заболевания, вызывающие повышение связанного билирубина: вирусный гепатит, цирроз печени, опухоль печени и метастазы, жировая дистрофия.