Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Изменение количества генов



Геном эукариотов обнаруживает высокую пластичность, играющую важную роль в регуляции активности некоторых генов и увеличивающую разнообразие клеточных ответов. У млекопитающих реализуются следующие варианты изменений в структуре генов:

 

Амплификация (или увеличение числа) геновиспользуется организмом в том случае, когда возникает необходимость увеличить синтез определённого генного продукта. Многие гены, кодирующие белки или РНК, необходимые организму в больших количествах (например, гистоны, рРНК, тРНК), постоянно присутствуют в амплифицированном соетрянии. Так, у человека 20% общего генома состоит из участков, кодирующих рибосомные, транспортные и ядрышковые РНК, последние из которых обеспечивают посттранскрипционные модификации РНК. Амплифицированные участки могут располагаться друг за другом (тандемно) в хромосоме или образовывать внехромосомные фрагменты ДНК, называемые двойными мини-хромосомами, их размер колеблется от 100 до 1000 килобаз (1 килобаза = 1000 пар нуклеотидов). Описано более 20 генов, способных амплифицироваться при определённых условиях.

К числу генов, для которых обнаружена амплификация, относят ген металлотионеина. Продукт экспрессии этого гена - низкомолекулярный белок металлотионеин, обладающий способностью связывать тяжёлые металлы (медь, цинк, кадмий, ртуть) и защищать клетки от отравления этими соединениями. Установлено, что в ответ на повышение концентрации тяжёлых металлов в крови в клетках происходит амплификация гена металлотионеина. Другими примерами генов, количество которых увеличивается под влиянием лекарственных препаратов, являются ген дигидрофолатредуктазы и ген Р-гликопротеина, ответственный за синтез белка, обеспечивающего множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток.

 

Утрата генетического материала -довольно редкий способ регуляции. Наиболее яркий пример потери всех генов за счёт разрушения ядра - процесс созревания эритроцитов. Нестабильны амплифицированные гены, двойные хромосомы. Они, как правило, исчезают в последующих генерациях. Утрата генетического материала происходит в процессе созревания лимфоцитов и образования плазматических клеток разных клонов, синтезирующих секретируемые формы иммуноглобулинов.

 

Перестройка генов. У высших организмов, так же как и у прокариотов, отмечают процесс обмена, перемещения генов между хромосомами или внутри хромосомы, объединение генов с образованием изменённой хромосомы, которая после таких структурных изменений способна к репликации и транскрипции. Этот процесс получил название "генетическая рекомбинация".

У эукариотов рекомбинации наблюдают:

· при половом слиянии яйцеклетки и сперматозоида;

· при перемещении подвижных генетических элементов - транспозонов, в состав которых входят отдельные гены или группа генов, с исходной позиции в какое-либо другое место той же или другой хромосомы;

· при формировании в лимфоцитах "библиотеки" генов, кодирующих антитела или иммуноглобулины.

Рассмотрим более подробно механизмы, обеспечивающие образование в организме каждого человека около 10 млн (107) различных антител, т.е. количества значительно большего, чем число всех других белков, существующих у каждого индивидуума. Антителас одинаковыми антигенсвязывающими свойствами синтезируются В-лимфоцитами, принадлежащими к одному определённому клону (т.е. группе клеток, возникшей из одной родоначальной клетки), При попадании в организм любого антигена среди имеющегося набора В-лимфоцитов всегда найдётся такой клон клеток, антитела которого имеют комплементарный ему активный центр. Антитела встроены в плазматическую мембрану В-лимфоцитов, и их антигенсвязывающие участки локализованы на поверхности клеток. Антиген, присоединяясь к активному центру антитела, вызывает пролиферацию клеток и превращение В-лимфоцитов в плазматические клетки, в которых идут активный синтез и секреция не связанных с мембраной антител.

Изучение вопроса о происхождении антител позволило сделать вывод о том, что огромное многообразие белков иммунной системы кодируется ограниченным количеством генетического материала, изменения в котором обеспечиваются рекомбинациями и соматическими мутациями (или изменениями в структуре ДНК, которые сохраняются при последующих делениях клеток).

 

Вспомним, что мономерные антитела - доменные белки, состоящие из двух идентичных тяжёлых (Н) цепей и двух идентичных лёгких (L) цепей. Лёгкие цепи имеют двухдоменную структуру и включают вариабельный (VL) и константный (CL) домены. Тяжёлая цепь состоит из 4-5 доменов: одного вариабельного (VH) и, как правило, трёх константных (СH). Иммуноглобулины - гликопротеины; их углеводная часть присоединяется к константной области Н-цепей. В связывании антигенов участвуют 2 активных центра антитела, образованные вариабельными областями Н-цепей (VH) и L-цепей (VL). L-цепи бывают двух типов: λ (лямбда) и κ (каппа), значительно различающиеся по первичной структуре С-областей. Наличие в антителах С- и V-областей позволило предположить, что гены, обеспечивающие синтез L- и Н-цепей, образуются в результате соединения двух участков гена, один из которых кодирует вариабельную область, а второй - константную. И действительно вскоре было установлено, что в зародышевых клетках и соматических клетках, не синтезирующих иммуноглобулины, участки гена, кодирующие V- и С-области L-цепей λ-типа, разделены протяжёнными нуклеотидными последовательностями, но сближены в зрелых В-лимфоцитах, синтезирующих Lλ Из этого следовал вывод о том, что в процессе дифференцировки В-лимфоцита из зародышевой клетки происходит "вырезание" протяжённого участка генетического материала, обеспечивающее сближение VL- и Cλ-областей с образованием полного гена L-цепи иммуноглобулина.

Этот процесс перестройки в геноме получил название соматической рекомбинации, так как он связан с созреванием лимфоцитов и не передаётся по наследству. Описано 3 разных семейства генных фрагментов, или сегментов, кодирующих строение L- и Н-цепей Ig. Два семейства ответственны за синтез лёгких цепей: сегменты, кодирующие строение L-цепей типа λ, расположены в хромосоме 22, генетический материал L-цепей типа к (каппа) - в хромосоме 2, а информация о всём разнообразии Н-цепей локализована в хромосоме 14. Полные гены L-цепейλ и κ типов в ходе дифференцировки собираются из 3 сегментов: вариабельного (VL), соединительного (JL) и константного (CL). Так, для L-цепей к типа обнаружено около 300 сегментов, кодирующих N-концевой вариабельный (Vκ) участок полипептидной цепи длиной в 95 аминокислотных остатков, 5 сегментов, в которых содержится информация об остальных 13 аминокислотах Vκ области, и 1 сегмент константной области. В зародышевых клетках 300 сегментов Vκ расположены в хромосоме последовательно на расстоянии 7 килобаз друг от друга. Каждый V-сегмент состоит из 2 экзонов, разделённых коротким интроном: лидирующий экзон (L) кодирует сигнальный пептид (20-25 аминокислотных остатков), а экзон Vκ - основную часть вариабельного домена. Семейство Vκ-сегментов отделено от группы соединительных сегментов (Тк) участком ДНК размером в 20 килобаз. Между последним из Jκ-сегментов и Сκ-экзоном, кодирующим домен константной области, расположен интрон размером в 2,4 килобазы. В ходе дифференцировки В-клеток один из вариабельных VL-сегментов путём соматической рекомбинации переносится из отдалённого участка в участок той же хромосомы, рядом с одним из сегментов JL. Например, сегмент V2 объединяется с соединительным мини-сегментом J4, и формируется полный ген L-цепи. Он состоит из 3 экзонов и 2 нитронов, расположенных в гене в следующем порядке: 5'L-I1-V2-J4-J5-I2-С-3', где L - лидерная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, I, - интрон V2-сегмента, а 12 - интрон между семейством JL-сегментов и Сκ-экзоном. После транскрипции гена в ходе сплайсинга из первичного транскрипта удаляются интроны I1, I2и лишний сегмент J5, а все кодирующие последовательности соединяются в единую информационную молекулу зрелой мРНК. В процессе синтеза L-цепи на рибосоме лидерный участок, состоящий в основном из гидрофобных аминокислот, обеспечивает прохождение белка через мембрану ЭР и затем отщепляется. Образуется L-цепь, имеющая аминокислотный состав, характерный для L-цепи κ-типа в молекуле Ig. Расчёты показывают, что из имеющихся сегментов κ-гена в организме можно синтезировать 4500 полных генов, кодирующих L-цепи κ-типа. Формирование полных генов L-цепей λ-типа происходит так же, как L-цепей κ-типа.

Ещё большее разнообразие вариантов возникает при сборке полных генов тяжёлых (Н) цепей Ig. Н-цепи кодируются четырьмя сегментами: VH, DH (от англ, diversity) сегментами разнообразия, JH и СH. У человека обнаружено около 500 VH, 15 DH и 4 JH сегментов. Каждый VH сегмент содержит информацию об аминокислотной последовательности сигнального пептида и около 100 аминокислот VH домена. В сегменте DH закодирован участок полипептидной цепи, содержащий от 2 до 13 аминокислот, а в сегменте JH - 4-6 аминокислот. Полный ген вариабельного домена образуется путём соединения VH, DH и JH сегментов. При формировании полного гена вариабельной части Н-цепи Ig, состоящей из VH, D и JH сегментов, происходит 2 рекомбинационные состыковки: на первом этапе удаляется участок между выбранными Dx и Jy кодирующими последовательностями, а на втором - между Vi и DxJy сегментами. Экзонов, кодирующих константную область Н-цепей, описано 10: Сμ, Сσ, Сγ3, Сγ1, Сα1, Сγ2α, Сγ2β, Сγ4, Сε и Сα2, они определяют классы и подклассы иммуноглобулинов - IgM, IgG, IgA и т.д. Первыми в иммунном ответе появляются IgM, поскольку к полному гену вариабельного домена ближе всех остальных С-экзонов находится Cμ, сегмент Н-цепи. Активированные В-клетки могут синтезировать мембранно-связан-ную и секретируемую формы IgM.

Кроме того, они могут переключаться с синтеза IgM на образование антител других классов. Перед каждым СH экзоном имеется участок ДНК, называемый "участок переключения", или "свич-сайт"(от англ, swich site), построенный из повторяющихся нуклеотидных последовательностей. Эти участки облегчают протекание дополнительной рекомбинации, в ходе которой удаляются С-сегменты между полным геном вариабельной области и С-сегментом того класса, который должен быть включён.

Исследование нуклеотидных последовательностей генов некоторых подклассов L-цепей к-типа и Н-цепей показало, что разнообразие структуры сегментов, закодированных в зародышевой клетке, увеличивают соматические мутации.Мутации происходят в дифференцированных клетках на участках VL-JL и VHDHJH сегментов в процессе или после рекомбинаций, делая, таким образом, количество антител практически неограниченным. Очень важно, что мутации происходят в областях, ответственных за узнавание антигенов, обеспечивая более полное соответствие активного центра антитела антигену.

Таким образом, перестройки генетического материала в процессе формирования полных генов Ig происходят в несколько этапов, каждый из которых приурочен к строго определённой стадии дифференцировки В-лимфоцитов. Из сегментов, которые кодируют различные участки полипептидной цепи, входящей в вариабельные домены, и одного из экзонов константного домена собираются полные гены тяжёлых и лёгких нитей Ig. Сборка L-цепей включает одну соматическую рекомбинацию, а сборка Н-цепей происходит с помощью двух соматических рекомбинаций. Когда В-лимфоциты синтезируют Ig не класса М, то это сопровождается ещё одним дополнительным рекомбинационным событием. Соматические мутации, происходящие в зрелых В-лимфоцитах, делают многообразие антител неисчерпаемым. Аналогичные процессы наблюдают и в ходе дифференцировки Т-лимфоцитов.

 

 

Регуляция работы генов у эукариот.

 

Регуляция транскрипции генов высших организмов сходна с регуляцией экспрессии генов прокариотов. Основное различие состоит в значительно большем количестве участков ДНК и регуляторных факторов, контролирующих этот процесс. У животных и человека различные гены экспрессируются в разные моменты времени и с разной интенсивностью. Здесь, так же, как у прокариотов, есть гены "домашнего хозяйства", транскрибирующиеся конститутивно, т.е. постоянно и во всех тканях. Это гены гликолиза, синтеза РНК и некоторых белков (например, альбумина). Существуют гены, транскрибирующиеся только в специализированных клетках, т.е. имеет место тканеспецифическая экспрессия. Например, экспрессия генов α- и β-цепей глобина происходит только в клетках-предшественниках эритроцитов. Многие гены подвергаются адаптивной регуляции и являются объектами индуцибельных воздействий или негативного контроля.

Ранее уже говорилось о том, что минимальный синтез любого белка поддерживается в том случае, если к ТАТА-участку промотора присоединяется ТАТА-связывающий белок, факторы транскрипции и РНК-полимераза, образующие инициирующий комплекс, осуществляющий синтез небольшого количества мРНК. Формирование комплекса - многоступенчатый процесс, от образования которого зависит скорость инициации транскрипции.

Идентифицировано более 100 различных белков, способных взаимодействовать со специфическими регуляторными последовательностями ДНК, влияя главным образом на процесс сборки транскрипционного комплекса и скорость транскрипции.

Эти белки имеют один или несколько доменов, обеспечивающих выполнение регуляторных функций.

ДНК-связывающие домены,ответственные за узнавание и связывание регуляторных факторов со специфическими участками на молекуле ДНК;

Домены, активирующие транскрипциюза счёт связывания с белками основного инициаторного комплекса: транскрипционными факторами, коактиваторами и РНК-полимеразой;

Антирепрессорные домены,благодаря которым белки способны взаимодействовать с гистонами нуклеосом и освобождать транскрибируемые участки ДНК от связи с этими ингибиторными структурами;

Домены, связывающие лиганды,присоединение которых к белку изменяет его конформацию и обеспечивает связывание с молекулой ДНК.

Лиганды-индукторы транскрипции - стероидные гормоны, ретиноевая кислота, кальцитриол (производное витамина D3) и гормоны щитовидной железы. Лигандами-репрессорами могут быть конечные продукты метаболических путей, некоторые гормоны. Будучи липофильными молекулами, они проходят плазматическую, а иногда и ядерную мембраны, взаимодействуют с внутриклеточными рецепторами, присоединяясь к лиганд-связывающему участку. Присоединение лиганда к рецептору образует ДНК-связывающий участок, узнающий специфическую последовательность в регуляторной зоне ДНК и индуцирующий транскрипцию определённых генов.

 

Схема регуляции транскрипции у эукариот разработана Г.П.Георгиевым (1972). Принцип регуляции (обратная связь) сохраняется, но механизмы ее более сложные. Единица транскрипции у эукариот называется транскриптоном. Он состоит из неинформативной (акцепторной) и информативной (структурной) зон. Неинформативная зона начинается промотором с инициатором. Далее следуют группа генов-операторов, за которыми расположена информативная зона. Информативная зона образована структурным геном, разделенным на экзоны (информативные участки) и интроны (неинформативные участки). Заканчивается транскриптон терминатором

 

Схема регуляции транскрипции у эукариот.

 

Работу транскриптона регулирует несколько генов-регуляторов, дающих информацию для синтеза нескольких белков-репрессоров. Индукторами в клетках эукариот являются сложные молекулы (например, гормоны), для расщепления которых требуется несколько ферментов (многоступенчатые реакции). Когда индукторы освобождают гены-операторы от белков-репрессоров, РНК-полимераза разрывает водородные связи между двумя цепочками ДНК транскриптона и по правилу комплементарности на нем сначала синтезируется большая молекула проинформационной РНК, списывающая информацию как с информативной, так и с неинформативной зон. В дальнейшем в ядре клетки происходит процессинг - ферментативное разрушение неинформативной части РНК и расщепление ферментами рестриктазами информативной части на фрагменты, соответствующие экзонам. Молекула и-РНК (моноцистронная), соответствующая экзонам структурного гена, формируется посредстров сплайсинга (сплавления) отдельных информативных фрагментов ферментами лигазами. Далее и-РНК выходит из ядра, идет в рибосомы, где и происходит синтез белка-фермента, необходимого для расщепления индукторов. Включение и выключение транскриптона происходит принципиально так же, как и оперона.

 

На молекуле ДНК на расстоянии 100-200 пар оснований от стартовой точки транскрипции имеются короткие специфические последовательности ДНК: СААТ - элемент (или бокс), CG-бокс и октамерный бокс (включающий 8 пар оснований), узнающие транскрипционные факторы. Эти элементы есть во всех клетках, и конститутивно экспрессируемые гены нуждаются только в них. В то же время для генов, подвергающихся адаптивной регуляции, обнаружены участки молекулы ДНК, которые удалены (до 1000 и более пар оснований) от промотора, но тоже участвующие в регуляции транскрипции. Эти нуклеотидные последовательности бывают 2 типов.

Энхансеры - участки ДНК размером 10-20 пар оснований, присоединение к которым регуляторных белков увеличивает скорость транскрипции. Если участки ДНК, связываясь с белками, обеспечивают замедление транскрипции, то их называют сайленсерами. Эти структурные элементы молекулы ДНК контролируют транскрипцию, даже если они ориентированы на молекуле ДНК в любом направлении (от 5'- к З'-концу или наоборот);

Элементы ответа, или cis-элементы -регуляторные последовательности ДНК, общие для группы генов. Они обеспечивают координированную регуляцию транскрипции генов и, как правило, располагаются на расстоянии примерно в 250 пар оснований выше промотора каждого гена. В остальном эти нуклеотидные последовательности имеют много общего с энхансерами.

В данном варианте регуляции один и тот же индуктор, связываясь с соответствующим регуляторным белком, может активировать много разных генов, так как каждый из них в регуляторной области содержит один и тот же cis-элемент. Один из белков-продуктов этой группы генов может оказаться индуктором другой группы генов. Конечный результат регуляции - серия ответных реакций за счёт активации различных генов одним индуктором. К генам, регулируемым cis-элементами, относят гены, чувствительные к стероидным гормонам, гены белков теплового шока и многие другие. Например, при повышении температуры или после какого-либо другого клеточного стресса активируется синтез транскрипционного фактора, который индуцирует транскрипцию генов, кодирующих строение шаперонов. Очевидно, что эффективность регуляции во многом зависит от структуры транскрипционных факторов и внутриклеточных рецепторов, непосредственно взаимодействующих с молекулой ДНК. Установлено, что большинство ДНК-связывающих белков принадлежит к трём семействам в зависимости от структуры домена, непосредственно взаимодействующего с двойной спиралью ДНК. Эти белки включают структуры типа "спираль-поворот-спираль", "цинковые пальцы" и "лейциновой молнии". Как правило, эти структуры - небольшие фрагменты молекул белков, а сайт-специфическое связывание происходит за счёт взаимодействия между радикалами аминокислот этих участков и азотистыми основаниями молекулы ДНК.

Посттранскрипционная регуляция.В организме животных существенное значение в обеспечении разнообразия белков играет посттранскрипционный процессинг РНК. Основные способы такой регуляции - альтернативный сплайсинг и изменение стабильности РНК.

Альтернативный сплайсинг.Установлено, что многие эукариотические гены, будучи транскрибированы, образуют несколько вариантов зрелой мРНК в ходе процессинга (или созревания) первичного транскрипта, имеющего полиэкзонное строение. Наиболее часто промотор сохраняется на одном из концов транскрипта, а в ходе сплайсинга происходит "вырезание" одного или нескольких экзонов. В других случаях в зрелой мРНК сохраняется часть интрона и включается в состав экзона с 5' или 3'-конца. Сплайсинг может влиять на выбор промотора или участка полиаденилирования. С помощью альтернативного сплайсинга в процессе синтеза антител образуются мембраносвязанные и секреторные формы антител. Так, первоначально В-лимфоциты продуцируют транскрипты, полиаденилированные после второго стоп-кодона, а интрон, в котором имеется первый стоп-кодон, удаляется. В результате синтезируются IgM, связанные с клеточной мембраной, так как мРНК таких клеток содержит на 3'-конце экзон, кодирующий участок полипептидной цепи, состоящий из гидрофобных аминокислот. С помощью этого участка происходит "заякоривание" IgM в мембране. Когда В-лимфоциты превращаются в плазматические клетки, то в езультате альтернативного сплайсинга образуется мРНК, в которой сохраняется интрон, содержащий первый стоп-кодон. Поэтому происходит более раннее полиаденилирование и исчезает экзон, кодирующий гидрофобный участок молекулы. Синтезируются укороченные молекулы антител, секретируемые в кровь.

"Редактирование" РНК.Описан ряд случаев, когда первичная структура мРНК изменяется ("редактируется") после транскрипции. Последовательность нуклеотидов в таких генах одинакова, а транскрибируемая в разных тканях мРНК различается в результате появления в молекуле замен, вставок или выпадений нуклеотидов. Пример "редактирования" РНК - образование апопротеина В (апо-В) в клетках печени и тонкого кишечника. Апо-В - основной компонент липопротеинов, участвующих в транспорте триацилглицеринов из этих тканей в кровь. Хотя апопротеин В кодируется одним и тем же геном, вариант белка, образующийся в печени, называют апо-В-100, и он содержит 4563 аминокислотных остатка, тогда как белок, синтезированный в клетках кишечника, состоит из 2152 аминокислот. В гене, кодирующем этот белок, последовательность нуклеотидов в триплете 2153 - САА и шифрует включение в полипептидную цепь остатка глутамина. В клетках кишечника в первичном транскрипте гена азотистое основание - цитозин (С) ко-дона 2153 дезаминируется и превращается в урацил (U). Возникает стоп-кодон - UAA, прекращающий трансляцию мРНК в середине молекулы и приводящий к синтезу укороченного белка. В результате образуется белок (В-48), длина которого составляет 48% от длины белка синтезируемого печенью.

Изменение стабильности мРНК.Для того, чтобы участвовать в синтезе белка, мРНК должна выйти из ядра в цитоплазму через ядерные поры. Установлено, что в ядре клеток обычно синтезируется больший набор гетерогенных РНК, чем тот, что выходит в цитоплазму. Многие продукты транскрипции подвергаются расщеплению нуклеазами, а те мРНК, что, транспортируются из ядра в цитоплазму, защищаются от гидролитического разрушения, образуя комплексы с белками. Время жизни эукариотических мРНК значительно больше (t1/2 составляет от нескольких часов до нескольких дней), чем t1/2мРНК прокариотов, равное нескольким минутам. Очевидно, что стабильность молекул мРНК - фактор, изменение которого влияет на уровень трансляции. Стабилизация мРНК при фиксированной скорости транскрипции приводит к накоплению и увеличению количества образующегося белкового продукта. Продолжительность жизни разных мРНК варьирует в достаточно широких пределах. Некоторые гены кодируют продукт с большой продолжительностью жизни. Так, в ходе транскрипции гена β-глобина образуется мРНК с t1/2, равной примерно 10 ч. Другие гены образуют мРНК с короткой продолжительностью жизни: мРНК, на которых синтезируются факторы роста, имеют t1/2 менее 1 ч. Показано, что поли(А)-фрагмент на 3'-конце мРНК увеличивает продолжительность жизни молекул. Чем длиннее поли(А)-фрагмент, тем больше время жизни мРНК. Описано много примеров регуляции количества синтезирующихся белков за счёт изменения продолжительности функционирования мРНК. Так, стабильность мРНК-матриц для синтеза молекул гистонов сильно зависит от фазы клеточного цикла. В S-фазе гистоны постоянно синтезируются и используются для укладки вновь образованной ДНК в нуклеосомы. Гистоновая мРНК в этот период стабильна в течение нескольких часов. После S-периода, когда ДНК уже не синтезируется, в клетках образуется небольшое количество гистонов, так как они не требуются для формирования нуклеосом. В этот период t1/2 для гистоновой мРНК составляет 10-15 мин.

 

 




Поиск по сайту:

©2015-2020 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.