Аэробные и факультативно-анаэробные бактерии

Первый этап –из исследуемого материала :

приготовление мазков с окраской по Граму, микроскопия мазков;

посев материала на плотную среду (МПА) в чашки Петри шпателем или бактериологической петлей для получения изолированных колоний →Т-т 37 °С, 24 ч.

При этом достигается механическое разъединение микроорганиз­мов на поверхности питательной среды, что позволяет получить их рост в виде изолированных колоний. В отдельных случаях иссле­дуемый материал вначале сеют в жидкую среду накопления, а затем пересевают его в чашки Петри с плотной ПС. Чашки с посевами обычно помещают в термостат на 18-24 ч при 37 °С.

Второй этап –изучение культуральных свойств бактерий (характер роста на питательных средах), посев для накопления чистой культуры:

учет роста на плотной ПС (МПА) – макро- и микроскопическое изучение колоний;

приготовление и микроскопия мазка (по Гр) из изолированной колонии;

пересев изолированной колонии на скошенный агар (МПА) для накопления ЧК→Т-т 37 °С, 24 ч.

Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете.Чашку поворачивают дном к себе и рассматривают колонии в проходящем свете. При наличии различных видов колоний их нумеруют и описывают каждую в отдельности. Обращают внима­ние на следующие свойства: а) величину колоний (крупные – более 4 мм в диаметре, средние – 2 – 4 мм, мелкие – 1– 2 мм, карликовые – менее 1мм); б) форму очертаний колоний (пра­вильно и неправильно округлая, розеткообразная, ризоидная и др.); в) степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная).

В отраженном свете рассматривают колонии со стороны крыш­ки, не открывая ее, и фиксируют в протоколе следующие данные: а) цвет колоний (бесцветные, пигментированные, цвет пигмен­та); б) поверхность (гладкая, блестящая, влажная, морщинистая, матовая, сухая и др.); в) рельеф (выпуклые, погруженные в среду, плоские, с куполообразным центром, с валиком по краю и др.).

Микроскопическое изучение колоний.Чашку устанавливают вверх дном на предметном столике микроскопа, опускают конденсор и с помощью объектива 8× изучают колонии, фиксируя в протоко­ле их структуру (гомогенная или аморфная, зернистая, волокни­стая и др.) и характер краев (ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые и др.).

Из части колоний готовят мазки (при взятии материала из ко­лонии отмечают ее консистенцию – сухая, слизистая, пастообраз­ная), окрашивают по Граму и микроскопируют, выясняя тинкториальные свойства микроорганизмов. При наличии однородных бактерий остаток колоний пересевают на скошенный агар для получения чистой культуры в достаточном количестве. Пробирки с посевами помещают в термостат на 18 – 24 ч при температуре 37 °С.

Третий этап – определение чистоты выделенной культуры, пересев на «пестрый ряд» для последующей идентификации:

мазок по Гр со скошенного агара для определения чистоты выделенной культуры:, заключение;

пересев полученной ЧК со скошенного агара на МПА (подтверждение чистоты и накопление культуры); МПБ (для определения на аммиак, индол, сероводород) и среды короткого «пестрого» ряда для последующей идентификации →Т-т 37 °С, 18-24 ч.

О чистоте культуры в мазках по Гр судят по однородности роста, формы, размера и окраски микроорганизмов. Для последующей идентификации выделенной ЧК, кроме изучения морфологических, тинкториальных и культуральных особенностей микроорганизмов, необходимо определить их ферментативные и антигенные свойства, фаго- и бактериоциночувствительность, токсигенность и другие признаки, характеризующие их видовую специфичность. Для определения биохимической активности (ферментативных свойств) полученную ЧК пересевают на «пестрый» ряд. Состав: МПА, поплавок, индикатор, углевод (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит и т.д.).

Четвертый этап – учет и анализ результатов исследования (ферментативной активности выделенной ЧК). Определение вида выделенной ЧК (идентификация) по морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Заключение (ответ).

Теория

Видовую принадлежность аэробных бактерий определяют путем сравнения обнаруженных морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств (чувствительность к фагам, бактериоцинам, а/б и т.д.) выделенной культуры со свойствами бактерий известных видов и вариантов. На четвертом этапе проводят учет результатов исследования, анализируют их и выписывают ответ по результатам посевов.

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы, используют дифференциально-диагностические среды Гисса. При ферментации бактериями углеводов с образованием кислоты цвет среды меняется за счет находящегося в ней индикатора, что создает впечатление пестроты («пестрый» ряд). В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий подбирают среды с соответствующими моно- и дисахарами (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза и др.), полисахаридами (крахмал, гликоген, инулин и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.), в процессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газообразные продукты (С0₂, Н₂, СН₄).

Протеолитические ферменты у бактерий обнаруживают различными способами, например, с помощью посева их в столбик питательного желатина. Посевы выдерживают при комнатной температуре (20 – 22 °С) в течение нескольких дней, регистрируя не только наличие разжижения, но и его характер (послойно, в виде гвоздя, елочки и т.д.).

Протеолитическое действие ферментов микроорганизмов можно также наблюдать при посевах на свернутую сыворотку, при этом вокруг колоний появляются углубления (разжижение). В молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватый цвет (пептонизация молока).

Показателями более глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода и других соединений. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы микроорганизмов в МПБ, 1%-ю пептонную или триптонную воду. Посевы выдерживают в термостате в течение 24–72 ч.

Для обнаружения индола по способу Ковача чистую культуру выращивают в пробирках на жидкой среде, богатой триптофаном, и добавляют несколько капель реактива Ковача (изоамиловый спирт – 150 мл, n-диметиламинобензальдегид – 10 мл, концентрированная соляная кислота – 50 мл). Индол, образовавшийся в ходе расщепления микробами триптофана, при взаимодействии с бензальдегидом образует окрашенные в красный цвет соединения – «розиндолы», поэтому при положительной реакции добавленная жидкость в течение нескольких минут становится малиново-красной.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой и пробкой пробирки. При взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца. В другом варианте в состав плотной среды вводят сульфат железа (П), который при взаимодействии с сероводородом образует черный преципитат сульфида железа (колонии образующих сероводород бактерий и среда вокруг них чернеют).

Индикаторы

Индикаторы, меняющие свой цвет при изменении рН среды, вводят в состав специальных сред, которые служат для выявления биохимических свойств микробов. Изменение цвета среды указывает на образование кислоты или щелочи при ферментативной деятельно­сти микробов. Известны индикаторы, приобретающие ту или иную окраску лишь при щелочной или кислой реакции; вне этой реакции они бесцветны – индикатор Андреде (красный в кислой среде при рН 6,5-7,2, в щелочной бесцветный); фенолфталеин (красный в щелочной среде при рН 8,3-10,0, в кислой бесцветный); фуксин (вишнево-красный в кислой среде в границах рН 7,4-7,7, в щелочной бесцветный).

Более удобны двухцветные индикаторы, имеющие разную окрас­ку в кислой и щелочной среде. Лакмусовая настойка, например, при кислой реакции приобретает розовую окраску, при щелочной – си­нюю. Часто применяют розоловую кислоту, которая в кислой сре­де – до рН 6,2-6,5 – имеет желтую окраску, а начиная от рН 6,5 приобретает бледно-розовый цвет, переходящий в интенсив­но-розовый при щелочной реакции (начиная от рН 7,2). Наиболее широко распространены индикаторы Кларка. Они имеют различную окраску в кислой и щелочной среде, а также хорошо выраженные переходные тона. Кроме того, диапазон чувствительности этих индикаторов весьма широк (таблица).

Предложен ряд комбинированных индикаторов, которые удобны в тех случаях, когда оттенки перехода от одного цвета к другому при изменении рН в определенных границах у од­ного индикатора недостаточно отчетливы. В сухих питательных средах применяют индикатор BP – смесь водного голубого и розо­ловой кислоты. В кислой среде он имеет синюю окраску, в щелоч­ной – красную, при нейтральной реакции – бесцветен. Индикатор действует в пределах рН 4,5–8,0.

Комбинированный индикатор Равич-Биргера и Мешалова (100 мл р-ра Андреде +0,4 г тимоло­вого синего )характеризуется оранжевым цветом в кислой среде (не ниже рН 3,0), желтым – в нейтральной и слабощелочной, фиолетовым – в щелочной среде.

Универсальный индикатор (Шосткинского завода химреактивов) представляет собой смесь нескольких индикаторов и имеет розово-красную окраску при рН 2,0, оранжевую – при рН 3,0–4,0, желтую – при рН 5,3–6,7, зеленую – при рН 6,9–8,0, синюю – при рН 9,0 и выше. Диапазон чувствительности этого индикатора очень широкий – от рН 2,0 до рН 9,0, но точность невелика (около 1,5–2,0 единиц рН). Поэтому его используют лишь для ориентировочного определения. Способ приготовления указан на этикетке.

Наиболее распространенные индикаторы Кларка

Поиск по сайту: