Лабораторно - практическая работа

Методика исследование микробного пейзажа пробы и дифференцирования бактерий по биохимическим свойствам клеточной стенки

Аппаратура, материалы, реактивы:

2. концентрированная серная кислота, полоски фильтровальной бумаги;

4. Хозяйственное мыло, пинцет, карандаш по стеклу,

5. Микроскоп;

Методика микрокопирования препарата

Для приготовления препаратов необходимы предметные и покровные стекла. Толщина предметных стекол желательно не более 1,2 - 1,5 мм.

Стекла перед употреблением предварительно обезжиривают погружением на 24 часа концентрированную серную кислоту и кипячением в течение 20 мин в «хромовой смеси». Затем стекла тщательно промывают в проточной водопроводной воде, помещают в банку со спиртом 96⁰, которую плотно закрывают притертой пробкой.

Спирт должен быть без следов жира. Перед употреблением стекла вынимают из банки пинцетом и высушивают на воздухе.

Провести описание микробного пейзажа мазков методом микроскопирования пробы.

Методика приготовления мазка

Методика приготовления мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде:

1. Приготовить рабочий стол;

2. Зажечь спиртовку и прокалить бактериальную петлю;

3. Петлей нанести на предметное стекло каплю воды;

4. Петлю обжечь;

5. Петлей взять небольшое количество исследуемого материала, соблюдая правила стерильности;

6. Перенести материал в каплю воды на предметном стекле и тщательно растереть, чтобы получилось мутное пятно;

7. Петлю вновь обжечь;

8. Зафиксировать мазок, проведя над пламенем 3-4 раза;

9. Дать мазку подсохнуть;

10. Окрасить по Граму.

Методика приготовления мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде:

При приготовлении мазка из жидкой питательной среды: каплюпитательной среды нанести на предметное стекло и фиксируют над пламенем горелки т.е. быстро проводят 3 раза над пламенем, так чтобы мазок прогревался до 70-80⁰С в течение 3-4 с, затем высушивают.

PS: Кроме фиксации над огнем, для мазков применима фиксация в метиловом спирте (5 мин) или в парах формалина (в сосуде Коплина) в течение 15 мин.

Окраска по Граму

Техника окраски по Граму:

1.Приготовить фиксированный мазок;

2. На мазок кладём фильтровальную бумагу;

3. На бумагу капнуть 1-2 капли генцианвиолета и окрасить в течение 1-2 мин;

4. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу и быстро споласкивают в водопроводной воде (15—30 сек), т.е. краску вместе с бумагой смыть (промывать водой не надо);

5. Окрасить препарат раствором Люголя на фильтровальной бумаге в течение 1-2 мин иди другим йодистым раствором;

Раствор сливают, мазок промывают водой (водопроводной или дистилированной).

6. Дифференцируют 96° спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно 20-40-60 секунд). Во время дифференцировки препарат все время покачивают.

Если вместо спирта использовать ацетон, то промывание продолжается 30 с. Можно дифференцировать смесью спирта и ацетона (1:1) 30 с.

7. Промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1 — 2 мин.

8. Дополнительно окрашивают (для выявления грамотрицательной группы бактерий) либо 0,5% водным раствором нейтрального красного (нейтральрот), либо разведенным (в 10 раз) карболфуксином Циля — 1-2-3 минуты. Возможна докраска сафранином (0,2-0,5 % водный раствор или 0,25 % раствор в 10 % спирте) основным коричневым (бисмаркбраун) либо пиронином J или В (2-5 мин).

9. Промывают в проточной воде 5 с и высушивают фильтровальной бумагой.

PS: 1. Очень удобно работать с полосками фильтровальной бумаги, предварительно пропитанной 1% спиртовым раствором одного из вышеуказанных красителей и затем высушенной. Такую окрашенную и высушенную бумагу накладывают на мазок и смачивают дистиллированной водой. Продолжительность окрашивания остается прежней (2—3 мин.).

2.Йодистые растворы:

1. по Граму:2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллированной воды, добавляют 1 г кристаллического йода, доливают до 300 мл дистиллированной воды;

2. по Вейгерту: 2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллированной воды, добавляют 1 г кристаллического йода до 100 мл дистиллированной воды.

3. Следует заметить, что в классической прописи при окраске по Граму обычно не промывают мазки в воде ни после окраски генциановым фиолетовым (кристаллическим фиолетовым), ни после обработки раствором Люголя, ограничиваются лишь сливанием растворов. Предлагаемое промывание в воде имеет целью только чистоту в работе, тем более, что оно ни в какой мере не отражается на результатах окрашивания.

В результатеграмположительные бактерии окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, грамотрицательные - в красный или коричневый в зависимости от красителя; ядра клеток — ярко-красные, цитоплазма — розовая.

Список литературы

1. Аристовская Т.В. и др. Большой практикум по микробиологии М., «Высшая школа», 1962. С.

2. Романенко В.И. Кузнецов С.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов. Лабораторное руководство. Л. 1974. 193с.

3. Бычкин П.В., Гительсон С.С., Агабабова Н.Б. Практикум по микробиологии. М. 1964. 143 с.

Поиск по сайту: