Структура білків і пептидів

Білки — це високомолекулярні біоорганічні сполуки, молеку­ли яких побудовані із залишків амінокислот, кількісно переви­щують усі інші органічні речовини, що є в складі живих організ­мів, і становлять понад половину їх сухої маси. Це сполуки, за допомогою яких генетична інформація дістає своє реальне вті­лення в побудові організму та всіх його властивостях. Якщо нуклеїнові кислоти є носіями генетичної інформації, то білки — носії фенотипової інформації, загальним втіленням якої є орга­нізм:

ДНК → РНК → Білок → Клітина → Організм.

Як відомо, ДНК хроматину клітинного ядра містить кілька ти­сяч генів, кожний з яких визначає певну ознаку організму. Ця ознака забезпечується структурною і функціональною систе­мами, що реалізуються в процесі синтезу різноманітних білків, які і визначають біохімічну індивідуальність організму. Певну структуру тканин визначають структурні білки — колаген, елас­тин, кератин; здатність до механічної роботи — скоротливі біл­ки актин, міозин; каталіз багатьох хімічних реакцій забезпечу­ють ферменти; транспорт кров'ю О₂, СО₂ та поживних речо­вин — транспортні білки: гемоглобін, альбуміни та ін.; регуля­цію обміну речовин і функцій організму — регуляторні білки: гормони типу інсуліну, глюкагону тощо; захист від кровотечі — білки системи зсідання, від інфекційних та вірусних хвороб — імуноглобуліни.

Білки всіх організмів побудовані з одного й того самого набо­ру 20 амінокислот. Разом з тим, у складі різних видів організмів налічується десятки тисяч різних білків, кожний з яких має певну структурну й функціональну організацію та біологічні власти­вості. Амінокислоти — це абетка білкової молекули, і як з пев­ної кількості літер можна створити безліч слів, так і з амінокис­лот у природі побудована велика кількість різноманітних білків. Кожна білкова молекула має певну будову, яка визначається послідовністю розташування амінокислот у поліпептидних ланцюгах, характерним розміщенням цих ланцюгів у просторі, здат­ністю створювати молекулярні структури у вигляді глобул або фібрил.

Вперше успішне вивчення будови білкових речовин було здійснено видатним вітчизняним ученим О. Я. Данилевським на­прикінці XIX ст. Він звернув увагу на те, що речовини білків та продуктів їх часткового гідролізу дають позитивну біуретову реакцію — синьо-фіолетове забарвлення при змішуванні з луж­ним розчином сульфату міді. Таку саму реакцію давали ро­зчини біурету (NH₂ — CO — NH — CO — NH₂). Нa основі цих спостережень О. Я. Данилевський дійшов висновку, що й у мо­лекулах білків амінокислоти сполучені між собою кето-імідними групами — CO — NH, які є в біуреті і які він назвав пептид-ними.

Рівні структурної організації білкових молекул.Вивчення структури білків — це шлях до розуміння механізму їх важливих біологічних функцій в організмі. Зокрема, знання струк­тури ферментів і особливо їх активних центрів дає змогу роз­крити механізми здійснення ферментативного каталізу. Вивчен­ня структури скоротливих білків — актину і міозину, які входять до складу м'язів, сприяє вивченню механізмів їх скорочення. Вивчення структури гормонів білкової природи — інсуліну, глю­кагону та інших — необхідне не тільки для вивчення механізмів регуляції обміну речовин, а й для опанування засобів синтезу цих гормонів з метою отримання лікарських гормональних пре­паратів. Просторова структура білкової молекули, властива будь-яким нативним білкам, має назву конформації білка. Будо­ва білків надзвичайно складна, що пояснюється великою кіль­кістю амінокислот у білкових молекулах, значною їх молекуляр­ною масою (від 5000 до кількох мільйонів і вище), утворенням різноманітних хімічних та фізико-хімічних зв'язків між різними атомними групами.

Для зручності вивчення будови молекул білка, їх розташу­вання в просторі визначають різні рівні структури білкової мо­лекули: первинну, вторинну, третинну і четвертинну.

Первинна структура — це певна послідовність амінокислот у молекулах білків та пептидів, сполучених між собою кова­лентними пептидними зв'язками. Первинна структура стабілі­зується також дисульфідними зв'язками, якщо вони є в білковій молекулі.

Вивчення первинної структури білка складається з кількох етапів. Спочатку визначають амінокислотний склад білка. Для цього здійснюють повний гідроліз білка в запаяних під ваку­умом ампулах під дією 6 М розчину НСІ (кислотний гідроліз) або 2—4 М розчину NaOH (лужний гідроліз) при 110 °С про­тягом 24 год. Добуту суміш амінокислот аналізують за допо­могою іонообмінної хроматографії. Для визначення послідов­ності амінокислот у поліпептидному ланцюгу білок обробля­ють протеолітичними ферментами (трипсином, хімотрипсином, амінопептидазою, карбоксипептидазою тощо), які гідролізують пептидні зв'язки між певними амінокислотами. Потім су­міш пептидів — продуктів часткового гідролізу — аналізують і визначають амінокислотний склад кожного пептиду, а також послідовність і взаєморозташування пептидів у молекулі біл­ка. При цьому враховують специфічність дії протеолітичних ферментів на поліпептидний ланцюг, беручи до уваги, що трип­син гідролізує пептидні зв'язки, утворені лізином і аргініном, хімотрипсин діє на пептидні зв'язки, утворені ароматични­ми амінокислотами фенілаланіном, тирозином, триптофаном тощо.

Для вивчення послідовності амінокислотних залишків у моле­кулах білків Ф. Сенгер розробив стандартний метод визначен­ня N-кінцевих амінокислот. Принципова основа цього методу полягає в тому, що до аміногрупи приєднують хімічну "мітку", яка не відщеплюється під час гідролізу білка. Якщо з гідролізату виділити таку мічену амінокислоту, можна визначити, який амі­нокислотний залишок розташований на N-кінці поліпептидного ланцюга білка.

Для "мітки" амінокислотних залишків Ф. Сенгер вико­ристовував динітрофторбензол (ДНФ). При обробці цим реактивом білка утворюється динітрофеніл-білок (ДНФ-білок):

У подальшому ДНФ-білок гідролізується з утворенням за­лишку молекули білка і ДНФ-амінокислоти:

ДНФ-амінокислоту виділяють із суміші продуктів гідролізу та ідентифікують за допомогою хроматографії. Залишок молеку­ли білка реагує з новими порціями ДНФ, усі наведені вище реакції повторюються і завершуються ідентифікацією другої амінокислоти. Реакції продовжуються доти, доки вся моле­кула білка не розпадеться на окремі ДНФ-похідні амінокис­лот.

Внаслідок тривалої роботи Ф. Сенгер у 1958 р. повністю встановив первинну структуру гормону інсуліну. Виявилось, що інсулін має два поліпептидних ланцюги — А і В, сполучені дво­ма дисульфідними містками. Ланцюг А має 21 залишок, ланцюг В — ЗО залишків амінокислот. Крім того, в ланцюгу А є дисуль-фідний зв'язок між залишками молекул цистеїну. Цікаво, що існує видова специфічність будови інсуліну, яка виявляється в амінокислотному складі поліпептидного ланцюга А. Якщо інсу­лін людини має у 8-, 9- і 10-му положеннях цього ланцюга амінокислотну послідовність залишків амінокислот — Тре — Сер — Іле —, то інсулін бика — Ала — Сер — Вал —, барана — Ала — Глі — Вал —, коня — Тре — Глі — Іле —. Інсулін свині має амінокислотну послідовність ланцюга А таку саму, як і у люди­ни, але в 30-му положенні ланцюга В він містить аланін замість треоніну. Відмінність первинної структури препаратів інсуліну, отриманих з підшлункових залоз різних тварин, пояснює неод­накову ефективність цих препаратів під час лікування цукрово­го діабету.

Для відщеплення та ідентифікації N-кінцевої амінокислоти значного поширення набув також метод, запропонований П. Ед-маном, що грунтується на застосуванні фенілізотіоціанату. Дос­ліджуваний пептид обробляють фенілізотіоціанатом, який взає­модіє з вільною а-аміногрупою N-кінцевої амінокислоти. У кислому середовищі відбувається розрив пептидного зв'язку, утво­реного N-кінцевою амінокислотою з рештою пептиду. Внаслі­док цієї реакції вивільняється фенілтіогідантоїнова похідна N-кінцевої амінокислоти, а досліджуваний пептид вкорочується на один мономер:

Отже, метод П. Едмана дає змогу послідовно вкорочувати пептиди на один амінокислотний залишок без пошкодження решти поліпептидного ланцюга. Фенілтіогідантоїнову похідну N-кінцевої амінокислоти можна ідентифікувати хроматографіч­ним методом, а послідовність операцій — повторити. Метод дає змогу визначати первинну структуру пептидів та білків (піс­ля їх часткового гідролізу трипсином) шляхом послідовного від­щеплення N-кінцевих амінокислот. Автоматизація цього методу реалізується в спеціальному приладі — "секвенаторі” (англ. "se­quence" — послідовність), що дає змогу досить швидко аналізу­вати пептидні ланцюги.

Сучасним методом, що дає можливість мітити та ідентифіку­вати N-кінцеві амінокислотні залишки в пептидах та білках, є також застосування дансилхлориду:

Дансилхлорид здатен реагувати з N-кінцевою амінокисло­тою, утворюючи дансильну похідну ("дансилування пептидів"). Після гідролітичного розщеплення всіх пептидних зв'язків у дослід­жуваному пептиді дансилована амінокислота може бути виді­лена та ідентифікована завдяки її специфічній флуоресценції.

Для ідентифікації С-кінцевих амінокислот у білках та пепти­дах застосовують гідразиноліз за Акаборі. Згідно з цим ме­тодом, досліджуваний поліпептид обробляють гідразином NH2 — NH2, що веде до розщеплення пептидних зв'язків і утво­рення гідразидів усіх амінокислот крім С-кінцевої. С-Кінцева амінокислота лишається у вільному стані і може бути виділена з реакційної суміші та ідентифікована.

Використання вищенаведених методів у поєднанні з різними способами розділення пептидів і амінокислот дало змогу вста­новити первинну структуру багатьох пептидів та білків, зокре­ма інсуліну (51 амінокислота), міоглобіну (153 амі­нокислоти), гемоглобіну (574 амінокислоти), рибонуклеази (124 амінокислоти), аспартат-трансамінази (412 амінокислот) тощо. Первинна структура біологічно важ­ливих пептидів. Пептидами є різноманітні фізіологічно активні сполуки, що містяться в біологічних рідинах та клітинах певних організмів, зокрема трипептид глутатіон, деякі гормони та медіатори нервової системи (окситоцин, вазопресин, нейро-пептиди тощо), регулятори імунокомпетентних клітин (інтерлейкіни, тимопоетини).

До пептидів належать також деякі природні токсини, що ма­ють отруйну дію або використовуються як високоефективні лі­карські засоби та інструменти фармакологічного аналізу (токсини бджіл, отруйних рослин та комах, нейротоксини з орга­нізму рептилій тощо).

Глутатіон — трипептид, що зустрічається в усіх живих кліти­нах, плазмі крові, еритроцитах і бере участь в окисно-віднов­них реакціях.

Утворення глутатіону:

Окситоцин і вазопресин — циклічні пептиди з дев'яти аміно­кислотних залишків (нонапептиди), що належать до гормонів задньої частки гіпофіза (нейрогіпофіза).

Енкефаліни (Мет-енкефалін та Лей-енкефалін) — представ­ники так званих опіоїдних пептидів, тобто сполук, що вплива­ють на морфінні (опіатні) рецептори головного мозку. Ці біологічно активні сполуки пригнічують відчуття болю, викликають стан психічного задоволення, ейфорію:

Тир — Глі — Глі — Фен — Мет;

Мет-енкефалін

Тир — Глі — Глі — Фен — Лей.

Лей-енкефалін

Тафцин і тимулін — пептиди, що регулюють функцію імунної системи, зокрема Т-лімфоцитів:

Тре — Ліз — Про — Apr;

Тафцин

Глу — Ала — Ліз — Сер — Глн — Глі — Глі — Сер — Асн.

Тимулін

Вивчення первинної структури білків та пептидів дає можли­вість з'ясовувати причину спадкових захворювань, що виника­ють внаслідок генних мутацій і синтезу в організмі аномальних білкових молекул. Наприклад, вивчення первинної структури гемоглобіну людей, хворих на серпоподібно-клітинну анемію, встановило, що при цьому захворюванні гемоглобін еритроци­тів відрізняється від нормального лише тим, що в Б-поліпептид-ному ланцюгу залишок глутамінової кислоти замінений на зали­шок валіну. Така заміна призводить до втрати біологічних влас­тивостей гемоглобіну. Вивчення гемоглобінопатій — захворю­вань, які супроводжуються порушенням функцій гемоглобіну — транспортного білка крові, що переносить О2 і СО2, сприяло відкриттю майже 100 патологічних форм гемоглобіну. Кожна з цих форм характеризується заміною одного залишку амінокис­лоти в А- або S-поліпептидному ланцюгу цього білка. (^Вториннаструктура білішу — це просторова конфігурація поліпептидного ланцюга переважно у вигляді а-спіраді, склад­частої Р-структури або інших утворів.

На основі рентгеноструктурних досліджень поліпептидів і білків Л. Полінг і Р. Корі встановили, що в складі природних глобу­лярних білків поліпептидні ланцюги можуть утворювати а-спі-раль (рис. 6), в якій на один виток припадає 3,6 залишку аміно­кислоти. Крок спіралі — відстань між витками — дорівнює 0,54 нм, кут підйому витка — 26°, висота одного залишку амінокислоти становить 0,15 нм. Радикали залишків амінокислот знаходяться на поверхні спіралі. Вирішальну роль у стабілізації а-спіралі

Рис.. Схема β-структури поліпептидних ланцюгів молекули білка.

відіграють водневі зв'язки. На ут­ворення а-спіралі впливає також розташування бічних радикалів залишків амінокислот.

Утворенню спіралі сприяють такі амінокислоти, як аланін, ва­лін, лейцин, метіонін, фенілаланін, тирозин, триптофан, гісти­дин, особливо коли вони розміщені підряд у поліпептидному ланцюгу. Навпаки, лізин, аргінін, серин, треонін, аспарагінова і глутамінова кислоти впливають дестабілізуюче на а-спіраль. Зокрема, поліпептиди, до складу яких входить лізин, не утворю­ють а-спіраль при рН = 7, оскільки радикали цієї амінокислоти в нейтральному середовищі мають позитивний заряд, що не дає їм змоги зближуватись. При цьому сила взаємного відштов­хування перевищує сили водневих зв'язків, необхідних для утво­рення а-спіралі.

Ступінь спіралізації поліпептидних ланцюгів білка залежить від його первинної структури. Так, молекули гемоглобіну і міог­лобіну спіралізовані на 75 %, альбуміну сироватки крові — на 50 %, пепсину — на 28 %, а хімотрипсину — лише на 14 %. Неспіралізовані ділянки поліпептидного ланцюга утворені р-структурами або невпорядкованими, аморфними перехо­дами.

Крім а-спіралі поліпептидний ланцюг може формувати іншу впорядковану конформацію, яка дістала назву р-структури, або складчастого шару. р-Структура утворюється поліпептидними ланцюгами, які розміщені паралельно і сполучаються між со­бою за рахунок водневих зв'язків між поліпептидними групами, розміщеними поруч (рис. 7).

β-Структура найбільш поширена в білках опорних тканин — колагені (білок сполучної тканини, сухожилля, шкіри), фіброїні (білок шовку), кератині (білок волосся). У багатьох білках одно­часно зустрічаються ділянки а-спіралі і р-структури. Наприклад, фермент рибонуклеаза містить у своєму складі 26 % β -спіралізованих ділянок і 35 % — β -структури, лізоцим — відповідно 40 і 12 %, хімотрипсин — 14 і 45 %.

Отже, вторинна структура кожної білкової молекули характе­ризується певним співвідношенням укладання поліпептидних ланцюгів у просторі у вигляді а-спіра-лей, β-структур та аморфних ді­лянок.

Третинна структура— це роз­ташування у просторі спіралізованих поліпептидних ланцю­гів з утворенням глобулярних або фібрилярних білкових мо­лекул.

Основною діючою силою в утворенні третинної структури є взаємодія радикалів амінокислот з молекулами води. При цьому неполярні гідрофобні радикали амінокислот неначе занурю­ються в глибину білкової молекули, утворюючи там "сухі" зони, тоді як гідрофільні полярні радикали розміщуються на поверхні молекули. Внаслідок цих процесів утворюється конформація, яка є термодинамічно найбільш вигідною для всієї молекули в цілому. Третинну структуру стабілізують водневі та іонні зв'яз­ки. На формування третинної структури значний вплив мають температура, рН та іонна сила розчину.

Застосування для вивчення будови білків рентгеноструктурного аналізу та інших фізичних методів дослідження дало змогу встановити третинну структуру близько 300 різних білків, у тому числі міоглобіну, гемоглобіну, пепсину, трипсину, хімотрипсину, лізоциму, фрагментів імуноглобулінів людини тощо. Приклад третинної структури міоглобіну показаний на рис. 8. лише ті білки, молекули яких містять кілька окремих поліпептидних ланцюгів, сполучених між собою в єдиний макромолекулярний білковий комплекс. Чет­вертинна структура білка — це просторове розміщення кількох білкових поліпептидних ланцюгів, кожний з яких має певні пер­винну, вторинну і третинну структури. Окремі білкові молекули, що входять до складу четвертинної структури, називаються про-томерами, або субодиницями, а білки, побудовані з них, — олігомерами, або мультимерами. Такі олігомерні білки мають звичайно парну кількість протомерів (2, 4, 6, 8, 10, дуже рідко понад 12) з молекулярними масами від кількох тисяч до 100 000. Важливо підкреслити, що окремі протомери найчастіше функ ціонально не активні, тобто не виявляють властивостей від­повідних ферментів, гормонів тощо. Функціональна і біологіч­на активність з'являється лише при утворенні олігомерного білка після формування четвертинної структури.

Прикладом білка з четвертинною структурою є, наприклад, молекула гемоглобіну, яка має молекулярну масу 64500, скла­дається з 574 амінокислотних залишків і є тетрамером, побудо­ваним з двох а-поліпептидних ланцюгів (кожен має по 141 за­лишку амінокислот) і двох β-поліпептидних ланцюгів (по 146 залишків амінокислот). Кожний з ланцюгів оточує гем, що роз­ташований у центрі молекули, містить у своєму складі один двовалентний іон заліза і може приєднувати молекулу О2.

Зв'язки між протомерами здійснюються за рахунок нековалентних зв'язків — водневих, гідрофільних, іонних, тому за пев­них умов можливе розділення олігомеру на протомери. Зокре­ма, молекула гемоглобіну при наявності деяких солей, сечови­ни або при зміні рН дисоціює на два а- і два β-ланцюги за рахунок розриву водневих зв'язків. Ця дисоціація обо­ротна — після видалення сечовини або солей з розчину відбу­вається спонтанна асоціація молекули гемоглобіну.

Прикладом олігомерної молекули є також вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), що складається з однієї молекули РНК і 2130 білкових субодиниць, кожна з яких має молекулярну масу 17500. Білкові протомери приєднуються до РНК, що утворює спіраль­ну структуру з 130 витків.

Багато ферментів мають четвертинну структуру, яка забезпе­чує не тільки їх каталітичну властивість, а й здатність змінювати ферментативну активність залежно від певних регуляторних факторів. Зокрема, молекула ферменту лактатдегідрогенази, що каталізує оборотне перетворення піровиноградної кислоти на молочну,складається з чотирьох протомерів, які містять два типи поліпептидних ланцюгів: Н — серцевий тип (від англ. he­art — серце) і М — м'язовий тип (від англ. muscle — м'яз). Завдя­ки різним сполученням субодиниць можливе існування п'яти форм ферменту. НННН, НННМ, ННММ, НМММ, ММММ. Такі різні форми одного ферменту мають назву ізо­ферментів. Роз'єднання протомерів супро­воджується втратою активності ферменту. Молекула ферменту фосфорилази а, який каталізує розщеплення (фосфороліз) глікогену в печінці, також має четвертинну структуру і є тетрамером. Четвертинна структура імуноглобулінів складається з легких (L) і важких (Н) поліпептидних ланцюгів, сполучених між собою нековалентними і дисульфідними зв'язками.

До фібрилярних білків, що мають чет­вертинну структуру, належить білок міозин, функція якого пов'язана із скороченням м'язів. Молекулярна маса його становить близько 500 000 (рис. 10). Молекула міози­ну має витягнуту форму, довжину 150 нм і товщину 2 нм. Діаметр головки молекули становить 16 нм. Субодиницями міозину є два важких поліпептидних ланцюги з моле­кулярною масою близько 210 000 і кілька легких ланцюгів з молекулярною масою близько 20 000. Кінець кожного важкого ланцюга утворює „головку", до складу якої входять легкі лан­цюги.

Існування олігомерних білків сприяє економії генетичної інфор­мації в організмі. Відомо, що структура кожного білка кодуєть­ся одним геном. Для забезпечення синтезу чотирьох поліпеп­тидних ланцюгів гемоглобіну потрібно два гени, один з яких кодує утворення а-ланцюгів, другий — р-ланцюгів. Якщо всі чотири ланцюги були б різні, потрібно було б чотири гени. Ще яскравішим прикладом цього принципу є фермент глутаматде-гідрогеназа, молекула якого має вісім однакових субодиниць, що кодуються одним геном.

Хімічний синтез пептидів та білків.У зв'язку з широ­ким застосуванням білково-пептидних препаратів у медицині, сільському господарстві, харчовій промисловості проблема штучного синтезу пептидів та білків має велике наукове та прак­тичне значення. Вперше пептидний синтез був здійснений ви датним німецьким хіміком Е. Фішером, який в 1901 р. отримав гліцилгліцин, а в 1903 р. запропонував хлорангідридний спосіб утворення пептидів.

Усі методи хімічного синтезу пептидів та білків, що існують у наш час, грунтуються на послідовному здійсненні таких трьох стадій (Ю. А. Овчинников, 1987): а) блокуванні (захисті) функціо­нальних груп амінокислоти або пептиду, що не беруть участі в реакції утворення пептидного зв'язку; б) конденсації активова­ної карбоксильної групи одного реакційного компонента з амі­ногрупою іншого компонента; в) видаленні захисних груп для отримання вільного пептиду (кінцевого продукту) або продов­ження синтезу.

Активацію карбоксильної групи в амінокислотах та пептидах здійснюють за рахунок утворення хлорангідридів, азидів, ариль-них ефірів, змішаних ангідридів при взаємодії карбоксилу з похідними вугільної кислоти, етилхлорформіатом.

Важливим внеском у проблему штучного синтезу пептидів та білків став запропонований Р. Мерифілдом метод твердофазного синтезу. Головна ідея цього методу полягає в закріпленні поліпептидного ланцюга, що утворюється, на полімерному не­розчинному носії, поверхня якого містить хлорметильні "якірні" групи. За допомогою розробленого методу Р. Мерифілд здійс­нив синтез пептидів брадикініну, ангіотензину та перший штуч­ний синтез ферментного білка — рибонуклеази. В методі рід-кофазового синтезу пептидів (за М. М. Шемякіним, 1965) як носій, на поверхні якого відбувається синтез, застосовують розчинний полістирол, що дає змогу збільшити швидкість ре­акцій синтезу.

Поиск по сайту: