Разработка ускоренного метода измерения лактозы в молоке с помощью биосенсора глюкозы крови

Аннотация

Существующие методы измерения лактозы в молочной продукции утомительны, занимают много времени и могут потребовать дорогостоящего оборудования и квалифицированных специалистов. Цель этого исследования заключалась в разработке нового и быстрого метода для обычного измерения лактозы в молочной продукции. Предложенный метод основан на быстром гидролизе лактозы с помощью β-галактозидаза и впоследствии измерения с помощью глюкометра. Глюкометры были разработаны после десятилетий научно-исследовательских и клинических испытаний и широко используются во всем мире людьми с диабетом для мониторинга их уровня глюкозы в крови. Метод был разработан и проверен серией экспериментов. В первом эксперименте были определены температура и время, необходимые для почти полного гидролиза лактозы. Впоследствии были оценены влияние глюкометров и их тест-полосок. Мы обнаружили, что показания не отличаются существенно. Однако тест-полоски значительно отличаются друг от друга. Во втором эксперименте предложенный метод прошел проверку с использованием различных концентраций растворов лактозы (1.9-6,5%) и сравнен с методом ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). В третьем эксперименте предложенный метод использовался для определения содержания лактозы в сыром молоке. Предложенный метод показывает возможность быстрого, обычного и недорого измерения лактозы в молоке и других молочных продуктах.

Введение

Лактоза является основным углеводом в молоке большинства млекопитающих. Содержание лактозы в коровьем молоке, как правило, между 4,4 и 5,2%. Лактоза также имеет большое значение благодаря ее экономической ценности и вкладу в сенсорные и функциональные свойства молочных продуктов. Быстрое и точное определение лактозы имеет решающее значение в процессе контроля брожения сыворотки сыра, а также мембранного отделения лактозы из сыворотки сыра. Следовательно, возможность быстрого и недорогого метода определения лактозы имеет будущее в молочной индустрии.

Доступны несколько методов для определения содержания лактозы молока и молочных продуктов, в том числе ВЭЖХ, ферментативный метод, поляриметрии и гравиметрический метод. Ферментативный метод имеет некоторые преимущества над остальными с точки зрения доступности реагентов в виде комплекта и оптимизированной процедурой для молока и других молочных продуктов. В совместном исследовании, проведенном Клейном и Траутом (1984), ферментативный метод сравнивался с гравиметрическим совместно с «АОАС» (Ассоциация аналитических сообществ). Они обнаружили, что содержание лактозы, определенное с помощью ферментативного метода на 0, 49% меньше чем в гравиметрическом методе. В отличие от этого Эссиг и Клейн (1983) сравнили ферментат. метод с методом снижения (восстан-я) меди и нашли соответствие между ними. Линч и соавторы (2007) рекомендуют корректировать длину пути и систему мер веса для фермент. метода и тем самым значительно улучшить производительность метода. Относит. отклонение воспроизводимости (RSDr и RSD R) для усовершенствованного метода было рассчитано по результатам 11 лабораторий и 8 пар повторов оказались 0, 29 и 0, 57% соответственно. В дополнение к этим методам «разница лактозы» является популярным упрощенным методом для косвенной оценки лактозы в таких молочных продуктах как молоко, сыр и сыворотка. Однако, погрешности измерений при определении общего содержания сухих веществ, белков, жиров и минералов объединены и происходят в результате высокой степени неопределенности в оценке лактозы. Кроме того, такие соединения как органические кислоты и другие засчитываются как лактоза. Некоторые исследователи предлагают различные биосенсоры для измерения лактозы в жидких пробах. Большинство биосенсоров базируется на амперометрическом или кондуктометрическом зондировании и требуют доп. исследований, которые должны применяться в качестве обычного метода в условиях молоч. завода.

Имеющиеся в настоящее время методы определения лактозы имеют ряд ограничений, в том числе достаточное время и необходимость в дорогостоящих приборах, а также квалифицированных специалистах. Следовательно, молочная промышленность нуждается в быстром и недорогом методе, который может быть выполнен с минимально подготовленным аналитиком. Для удовлетворения этих требований, экономически эффективный подход заключается в адаптации существующей технологии и использовании ее для определения лактозы в молоке и молочных продуктах. В связи с этим, предлагается новый метод использования имеющихся в продаже биосенсоров глюкозы в крови.

Глюкометры крови были разработаны после нескольких десятилетий интенсивных исследований и клинических испытаний. Они используются во всем мире, чтобы контролировать концентрацию глюкозы в крови. Технология глюкометров и их клинические и технологические оценки можно найти в различных публикациях. Глюкометры крови чрезвычайно удобны для пользователей и занимают совсем немного места. Первым шагом в использовании глюкометров для измерения лактозы в молочных продуктах является гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы используя б-галактозидазы. Этот шаг используется в любом методе, связанном с ферментативным определением лактозы. Реакция выглядит следующим образом: лактоза + H2O———>глюкоза + галактоза.

Количество глюкозы образуется в процессе гидролиза лактозы пропорционально количеству лактозы в образце. В дальнейшем концентрация глюкозы определяется с помощью глюкометра крови. Показания глюкометра затем используется для определения концентрации лактозы в образце. Цель настоящего исследования состояла в разработке и оценке метода определения лактозы в молоке с помощью глюкометра.
Материалы и методы.
Экспериментальный дизайн

Экспериментальный подход был проведен в 3 эксперимента. В первом эксперименте, идеальные условия для полного гидролиза лактозы и эффект глюкометра и тест-полосок много изучались. Во втором эксперименте, предложенный метод был проверен с помощью 25 образцов растворов лактозы с использованием 5 лотков тест-полосок. В последнем эксперименте новый глюкометр-метод был оценен на молоке.
Образцы растворов
Образец раствора лактозы был подготовлен ​​путем растворения моногидрата лактозы в дистиллированной воде для получения концентрации 0,38% лактозы.0,38% раствор разбавляют дистиллированной водой для создания 8 образцов растворов лактозы. Концентрация лактозы позднее была подтверждена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на основе эталонного метода. Свежее образцы растворов лактозы были подготовлены в ходе этого исследования и проанализированы в тот же день.

Глюкометр

Relion Ultima самоконтролирующиемые глюкометры крови и тест-полоски использовались для измерения концентрации лактозы в образцах растворов, а также в пробах молока. Глюкометр и тест-полоски были приобретены в местном супермаркете. Рабочий диапазон измерения сахара в крови был от 20 до 500 мл / л (0, 02 – 0, 05% массы/объем). Любое измерение, выше или ниже этого диапазона был показан на глюкометре, как "LO" или "HI" соответственно.
Теоретически, глюкометр любого производителя может быть использован для измерения концентрации лактозы в молоке и молочных продуктах. Однако наиболее важным фактором при выборе глюкометра для измерения лактозы является то, что на некоторые глюкометры и тест-полоски влияет наличие галактозы, мальтозы или ксилозы. Галактоза было нашей главной задачей, поскольку она является одним из конечных продуктов гидролиза лактозы. Глюкометры, которые реагируют на глюкозу дегидратированного пирролохинолинхинона-хинон или глюкозу принципы краситель оксидоредуктаз не относятся к глюкозе и могут дать повышенные показания счетчика глюкозы в присутствии галактозы. Тем не менее, глюкометры и тест-полоски, которые реагируют на глюкозу дегидратированного никотинамид аденин динуклеотида (GDH-NAD), глюкозо-оксидазы или гексокиназы глюкозы являются наиболее подходящими для определения лактозы в молоке. Глюкометр Relion используется в настоящей работе на основе GDH-NAD и не подергается влиянию галактозы. Sehleis предоставило список мониторинговых систем уровня глюкозы вместе с ферментом, используемым в каждой из систем.

Фермент
B-галактозидазой, обычно называется лактаза, была получена Корпорацией ферментного развития(Нью-Йорк). Фермента имел активность от 2300 до 2700 единиц дрожжей лактазы / г. Он является производным от молочных дрожжей рода Klyveromyces и имеет оптимальную активность в период между 31 и 40ºС.
Высокоэффективная жидкостная хроматография на основе эталонного метода.
Система ВЭЖХ, оборудованная растворимым модулем доставки, многоканальным детектором сканирования длины волны(190-600 нм), и 20 мл образца впрыска топлива, была использована для измерения концентрации лактозы в образцах растворов и молока. Система ВЭЖХ также включает детектор индексов преломления и модель 631 колонка нагреватель.300 - * 7,80-мм ионного исключения колонки поддерживается при температуре 65ºС был использован для выделения лактозы. Серная кислота используется в качестве подвижной фазы со скоростью от 0, 6 мл / мин. Подвижной фазы была подготовлена путем растворения серной кислоты в ВЭЖХ-уровне воды.

Пример приготовления образца раствора лактозы.

Около 0, 5 мл разбавленного молока выливают в центробежный фильтр с молекулярным весом отсечки 3 кДа. Пробирки центрифугируют в 17, 746 * г в течение 15 мин. Собранный фильтрат встряхивают и вводят в систему ВЭЖХ. Лактозы была подсчитана в пробах молока на основе внешнего стандартного метода, как описано Upreti соавт.
Эксперимент 1
В эксперименте 1, усилия были направлены на сокращение времени, необходимого для полного гидролиза лактозы, а также на изучение факторов, влияющих на показания глюкометра. Первоначально был проведен эксперимент по оптимизации условий, необходимых для полного гидролиза лактозы. Для этой цели был выбран 0, 35% раствор лактозы, который был близок к наибольшей концентрации образца раствора лактозы. Мы предположили, что оптимальные условия для полного гидролиза по 0, 35% лактозы, могут быть применены к более низкой концентрации лактозы. Серию стеклянных пробирок с 5 мл 0, 35%-ным раствора лактозы и 0, 1 мл б-галактозидазы инкубируют при 4 выбранных температурах на водяной бане. Пробирки, содержащие растворы лактозы были удалены из водяной бани через заданные промежутки времени и помещены в кипящую водяную баню на 5 мин для инактивации фермента. Особая осторожность необходима, для того чтобы предотвратить потерю влага в процессе инактивации. Гидролизованный раствор лактозы затем охлаждают до комнатной температуры и анализируют на лактозу с использованием ранее описанного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Затем был проведен эксперимент для оценки воздействия глюкометра, тест-полосок и концентрации лактозы в образце раствора на показания глюкометра. Для этой цели мы использовали расчет случайного факториала с 3 факторами. Для этого 5 мл раствор лактозы и 0, 1 мл фермента лактазы встряхивали и инкубировали при 40ºС. Через 10 мин, образец был проанализирован 2 глюкометрами с использованием 2 срий тест-полосок. В каждой партии тест-полоски, трижды измерения были записаны. Показания глюкометра были сведены в таблицу и проанализированы с помощью процедуры PROC GLM в SAS.
Эксперимент 2
Целью эксперимента 2 была для проверка предложенного метода в образцах раствора. Для проведения этого эксперимента, был использованы 1 глюкометр и 5 серий тест-полосо. Первоначально, калибровочные кривые были получены по показаниям глюкометра каждой партии тест-полосок с использованием 8 стандартных образцов растворов лактозы в диапазоне от 0, 05 до 0, 38% (0. 05, 0. 09, 0. 14, 0,19, 0 24., 0,29, 0. 33 и 0. 38%). Каждый стандартный раствор был проанализирован в двух экземплярах, чтобы записать показания глюкометра. Одновременно, стандартные образцы были проанализированы на концентрацию лактозы с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии на основе эталонного метода. Универсальная модель калибровки была разработана на основе объединения данных из всех серий тест-полосок для разработки единой модели регрессии. Кроме того, показания из каждой партии тест-полосок и соответствующие им концентрации лактозы в ВЭЖХ на основе эталонного метода были индивидуально проанализированы, чтобы разработать ряд конкретных уравнений растворов лактозы для каждой серии тест-полосок. Впоследствии, 25 новых стандартных растворов лактозы, которые варьировались в концентрации от 1,9 до 6,5% лактозы были подготовлены отдельно (путем растворения лактозы в дистиллированной воде) и измеряют концентрацию лактозы с использованием предложенного глюкометр метода. Концентрация лактозы, используя метод калибровки уравнений и калибровки уравнения из объединенных данных была определена.

Концентрации лактозы, полученные от каждой партии тест-полосок с использованием глюкометра и метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на основе эталонного метода, были сведены в таблицу и сравнены с помощью статистического метода сравнения, включая регрессионный анализ. MS Excel была использована для разработки моделей линейной регрессии. С помощью регрессионного анализа, статистические параметры, такие как тангенс (градиент), цена деления, их 95% доверительные интервалы, и стандартное отклонение остатков были извлечены. Кроме того, парный Т-тест был проведен для оценки соответствия между методом ведения и предлагаемым методом. Другие показатели, такие как средняя разница (d) и средняя разница в процентах (D) также используется для оценки производительности предлагаемых методов.
Эксперимент 3
В эксперименте 3, калибровочные уравнения были разработаны с использованием раствора обезжиренного молока и метод был проверен с использованием 10 образцов сырого молока. Были подготовлены р-ры обезжиренного молока, содержащие 3,5% белка и различные концентрации лактозы (ориентированные на 2, 3, 4, 5 и 6%) с использованием молока белкового концентрата 85, обезбелоченной сыворотки и дистиллированной воды. Калибровочные образцы были проанализированы на фактическое содержание лактозы с помощью ранее описанных ВЭЖХ на основе эталонного метода. Для глюкометр-метода, около 1 г молока обезжиренного разбавляют 20 г дистиллированной воды. Часть разбавленного образца (5 мл) смешивают с 0.1 мл б-галактозидазы и инкубируют при 40 ° C в течение 10 мин. Две серии тест-полосок (дубликат измерений в каждой партии) были использованы для оценки каждого образца, а также много конкретных и универсальных (на основе объединения данных серий полосок) калибровочных кривых было разработано.
Десять образцов сырого молока были получены от отдельных коров в Научно-исследовательском молочном и Учебный центр. Каждый образец анализировали на содержание лактозы с использованием глюкометр-метода и ВЭЖХ на основе эталонного метода. В предлагаемом способе глюкометр-метода, 1 г молока разбавляют 20 г дистиллированной воды и встряхивают. Затем 0,1 мл б-галактозидазы был добавлен в 5 мл разведенной пробы молока и выдерживан при 40 ° С на водяной бане. Через 10 мин разведенный образец молока встряхивают и анализируют в двух экземплярах с использованием глюкометра. Концентрация лактозы рассчитывается по глюкометр показаниям с использованием универсальных и специфических моделей калибровки. Показания содержания лактозы, полученные с использованием глюкометр-метода и выше описанного метода были сопоставлены.

Концентрации лактозы, полученные от каждой партии тест-полосок с использованием глюкометр метода были сравнены с ВЭЖХ на основе эталонного метода методом сравнения статистики, включая регрессионный анализ. Программа MS Excel была использована для разработки моделей линейной регрессии. Статистические параметры, такие как тангенс, цена деления, их 95% доверительные интервалы, и стандартное отклонение остатков были извлечены. Кроме того, парный Т-тест был проведен для оценки соответствия между методом ведения и предлагаемым методом. Кроме того, парный т-тест был проведен для оценки соответствия между 2 методами. Кроме того, другие показатели, такие как d и D были использованы для оценки производительности предлагаемых методов.
Результаты и обсуждение
Эксперимент 1
Гидролиз лактозы. Гидролиз лактозы с использованием B-галактозидазы был первым шагом в предлагаемом методе измерения сахара глюкометром. На рисунке 1 показано постепенное снижение лактозы во время инкубации с б-галактозидазой. Лактоза не была обнаружена в ВЭЖХ-методе после 15, 10, 8 и 6 мин инкубации при 20, 25, 30 и 40 ° C, соответственно. Следовательно, лактоза полностью гидролизировалась в течение 10 мин при температуре инкубации от 25 до 40ºС. Косински (1981) сообщил, что скорость гидролиза лактозы зависит от температуры. В оставшейся части нашего исследования, условия гидролиза были стандартизированы на уровне 2% фермента инкубации при 40 ° С в течение минимум 10 мин.
Воздействие глюкометра, тест-полосок, а также концентрации лактозы. Как показано в Таблице 1, показания глюкометра значительно (P <0,05), зависели от тест-полосок и начальная концентрация лактозы в стандртных растворах. Тем не менее, глюкометр и взаимодействие условий не были статистически значимыми (р> 0,05). Kirstensen соавт. изучал изменения во внешней оценке качества глюкометров. Авторы пришли к выводу, что разница была значительной и обнаружили столько же, сколько 1,3 ммоль / ч (2,34 мг / дл), разница в контрольных растворах. Как показано в Таблице 2, средняя абсолютная разница между сериями тест-полосок была относительно высокой (16 мл / л) на самых высоких концентраций лактозы (381 мг / дл) проанализировали. Тем не менее, для остальных концентраций лактозы (от 48 до 333 мг / дл), средняя абсолютная разница была меньше, чем сообщалось ранее значения, это, вероятно, связано с достижениями в области технологии тест-полосок, так как предыдущие исследования Kirstensen соавт.

Поиск по сайту: