Основні електрохімічні принципи амперометричного методу вимірювань

В електрокаталітичному режимі інгібітор (токсична речовина) блокує активність ацетилхолінестерази, зменшуючи пероксидазний електрокаталітичний струм через поверхню електрода. Чутливість біосенсора доведена до 10^{-12 М нейротоксину.}

Робочі електроди амперометричних перетворювачів виготовляють із благородних металів (Pt, Ag, Au), нержавіючої сталі, електропровідних полімерів, різних форм вуглецю та композитних матеріалів. Динамічний діапазон амперометричних сенсорів менший порівняно з потенціометричними, діапазон лінійної концентраційної залежності охоплює 2-4 порядки з нижньою межею визначення концентрації токсикантів 10^-7…10^{-12 М, яка визначається речовиною аналізатором, методом іммобілізації та часом інкубації в розчині інгібітора. Час інкубації лежить в межах 3…30 хв. – менший порівняно з потенціометричними біосенсорами.}

Недоліком амперометричних перетворювачів є інтерференція з боку електроактивних сполук. Тому для підвищення вірогідності та точності аналізу доцільно комбінувати амперометричний датчик з перетворювачем, що працює на іншому фізичному ефекті, наприклад, тепловому, за допомогою якого реєструється зміна температури в ході біохімічної реакції.

Перетворення сигналів первинного перетворювача здійснюється за допомогою спеціального модуля, де відбувається виділення інформативних параметрів цього сигналу та їхньої нормалізації для подання результатів вимірювання в зручній для реалізації формі.

Вихідний сигнал датчика у вигляді активної величини (електричного струму) можна виміряти з дуже високою точністю за допомогою компенсаційно-мостових вимірювальних пристроїв. До складу таких приладів входить генератор тестового сигналу, що подається на датчик, вторинний перетворювач вихідного сигналу датчика і мікропроцесорний базовий модуль на основі частково урівноваженого моста змінного струму з високорозрядним аналого-цифровим перетворювачем. Цей модуль через стандартний інтерфейс підключається до персонального комп'ютера із спеціальним програмним пакетом верхнього рівня, який забезпечує збір, обробку і накопичення поступаючих даних.

Розроблена електродна система складається з шести електродів: чотирьох робочих, порівняльного та допоміжного (Рис.1). Кожен робочий електрод відповідає одному з вимірювальних каналів, тому за допомогою такого сенсора можна вимірювати одразу 4 параметра досліджуваного розчину. Перетворювачі відрізняються матеріалами та площею робочих електродів. Збільшення площі робочого електрода (Рис.1 (б)) дозволяє частково її закрити захисним шаром, що забезпечує можливість контролю площі активної поверхні приладу.

а б

Рис.1. Конструкція амперметричного перетворювача.

Струмопровідні шини за виключеням активної області та зони контактів покриваються захисним шаром. В якості такого шару використовується фоторезист ФП383, товщиною 1,5-2 мкм, здублений за температури 1500С протягом 30 хв. В якості підкладки використовувався ситал односторонньої поліровки марки СТ-50-І-0,6 з класом поліровки робочої поверхні – 13-14.

Металізація пластин проводилась методом магнетронного розпилення на установці вауумного напилення «Катод-1М». В якості провідної системи використовувались плівки Ті-Ni та Ті-нержавіюча сталь. Для формування адгезійного підшару Ті використовувалась мішень марки ВТ1-00.

Рис. 2. Амперометричні перетворювачі

Для амперометричних вимірювань, що не потребують високої точності задавання потенціалів розчину відносно робочого електрода, може використовуватися схема представлена на рис. 3.

Рис. 3. ЕХВК – електрохімічна вимірювальна комірка, що являє собою посудину з досліджуваним розчином, у який занурені робочий електрод РЕ та допоміжний електрод ДЕ. До робочого електрода підключається вимірювач струму ВС. На допоміжний електрод подається напруга Uо.

При зануренні електродів комірки в розчин між робочим електродом і розчином утвориться приелектродний потенціал. При цьому потенціал робочого електрода може бути прийнятий нульовим, оскільки цей електрод з’єднаний із загальним через низький вхідний опір вимірювача струму. Приелектродний потенціал відносно загального проводу може змінюватися при зміні напруги на допоміжному електроді, що створює умови для протікання тих або інших окислювально-відновних реакцій.

Реалізація такої схеми вимірювання можлива за допомогою базового модуля М3500Р, що виконує функцію термінала информативно-вимірювальної системи. Призначенням термінала є подача на вимірювальну комірку робочої напруги U₀, перетворення струму І_x, що протікає через комірку в напругу U_вих, перетворення цієї напруги в цифровий код і передача останнього в персональний комп'ютер. Крім того, вимірювальна система повинна забезпечити встановлення необхідної величини U₀ і масштабування U_вих у досить широкому діапазоні зміни І_x.

Функціональна електрична схема амперометричної вимірювальної системи приведена на рис. 4.

Рис. 4. Функціональна електрична схема вимірювальної системи:

1 - джерело опорної напруги живлення вимірювальної комірки (2); 3 - операційний підсилювач з регульованим опором в ланцюзі зворотного зв’язку R_ос; 4 - аналого-цифровий перетворювач; 5 - буфер даних АЦП; 6 - мікропроцесорний контролер МПК; 7 - регістр управління; 8 - цифрове індикаторне табло; 9 - блок інтерфейсу; 10 - клавіатура.

Для вивчення продуктів електрохімічної реакції широко застосовують метод циклічної вольтамперометрії. Він має особливо велике значення на стадії попередніх досліджень, оскільки кожна особливість вольтамперних кривих відповідає конкретному явищу. Розглянемо типову циклічну вольтамперограму (рис. 5).

Рис. 5 Типова циклічна вольтамперограма процесу відновлення

У початковій точці А струм малий. Між точками А і В спостерігається дуже повільне збільшення струму, що зумовлюється нефарадеївськими взаємодіями, а саме — адсорбційними та ємнісними ефектами. Іноді такий струм називають фоновим. У точці В потенціал наближається до потенціалу відновлення Ох-частинки. Збільшення потенціалу спричиняє рух електронів з електрода на Ox-частинку, внаслідок чого зростає швидкість її відновлення і, відповідно, струм. Відновлені частинки беруть участь у зворотному процесі.

Коли прикладений потенціал підвищується, збільшується і струм , що виражається у посиленні загального струму (ділянка ВС). Однак, це збільшення не триває нескінченно, оскільки в процесі відновлення концентрація Ох-частинок на катоді зменшується, тобто на струм накладаються дифузійні обмеження. В результаті, на вольтамперограмі спостерігаються пік відновлення (точка С) і подальше зменшення струму. Співвідношення концентрацій окисненої і відновленої форм описує рівняння Нерста:

.

Струм у максимумі кривої зростає пропорційно концентрації окисненої форми частинок Ох та кореню квадратному зі швидкості розгортання потенціалу. Це один з основних результатів, який використовують у каталізі.

Коли в процесі відновлення кількість Ох-частинок на поверхні електрода починає зменшуватись, їх місце займають Red-частинки. У разі зміни напрямку прикладеного до електрода потенціалу на протилежний, спостерігається зворотний ефект. Після досягнення окисно-відновного потенціалу, Red-частинки починають переокиснюватись до Ох-частинок. Струм збільшується у зворотному (окиснювальному) напрямку доти, доки не буде досягнутий пік окиснення. На рис. 5 показано обидва піки, один відповідає відновленню субстрату (С), інший — переокисненню продукту назад у субстрат (D).

Крім того, у повністю оборотній системі стандартний окисно-відновний потенціал (потенціал, за якого на поверхні електрода є обидві форми частинок в однакових концентраціях) дорівнює потенціалу півхвилі E_1/2, тобто потенціалу, за якого значення струму дорівнює половині максимального.

Все вищесказане можна застосувати й до реакцій, в яких беруть участь каталітичні компоненти, зокрема ферменти. У цьому разі реакція описується рівнянням:

; ,

де , — псевдостала першого порядку.

У такій системі відновлена форма частинок може бути регенерована ферментом. Якщо значення мале, то ферментативна реакція впливатиме на кут нахилу вольтамперограми неістотно і ми матимемо типову вольтамперометричну криву для зворотної реакції. Якщо ж значення , велике, то Ox-частинки дуже швидко відновлюватимуться ферментом і на вольтамперограмі фіксуватимуться значні зміни, які виражаються у наявності плато замість піка С. Струм у ділянці такого плато описується рівнянням:

,

де , — коефіцієнт дифузії електроактивних частинок;

, — концентрація Ох-частинок в об'ємі розчину.

Значення можна знайти експериментально з використанням співвідношення дифузійно контрольованого і каталітичного струмів.

1. Принцип роботи системи

Мультисенсорний амперометричний комплекс, за допомогою якого проводиться вимірювання під час виконання даної роботи, схематично зображений на рис. 6, а фотографія наведена на рис. 7. До складу вимірювальної системи входять блок утримувача сенсорів (БУС) з планарним амперометричним мультисенсором (АМС), вимірювальний блок (ВБ), портативний персональний комп’ютер ПК і магнітна мішалка (ММ). Мультисенсорна електрохімічна комірка встановлюється в роз'ємі сенсорного блоку, що кріпиться на штативі, і з’єднується кабелем з вимірювальним блоком. Комірка занурюється в досліджуваний розчин, який знаходиться в реакторній кюветі, що встановлюється на мішалку. Вимірювальний блок складається з уніфікованої частини - базового модуля та потенціостата, через який підключається електрохімічна комірка. Вимірювальний блок з'єднується з комп'ютером за допомогою інтерфейсного кабелю через COM-port або USB-port.

Живлення ВБ здійснюється від блока живлення - мережевого адаптера 220/9 В або від вбудованого акумулятора. Програма верхнього рівня для обробки даних вимірювання та управління вимірювальним комплексом надається користувачеві на дискеті й інсталюється в персональному комп’ютері.

Рис. 6. Схематичне зображення мультисенсорного комплексу

Рис. 7. Фотографія мультисенсорного амперметричного комплексу

Програми, що забезпечують інтерфейс із користувачем надають користувачам амперометричної системи можливість встановити необхідні режими і параметри за допомогою додаткових органів керування. Встановлюються: режим вимірювання (з фіксованою напругою управління U_уп або такою, що циклічно змінюється), діапазон вимірювання струму (від 0...20 нА до 0...20 мкА), адреса (номер) підключеного модуля, циклічність обміну даними між модулем і ПК. Для сумісності із закордонними аналогами деякі назви органів керування подані англійською мовою.

Рамка "Методы" використовується для зазначення методу дослідження. Передбачено два методи:

- метод "amperometric detection" (статичний) – для дослідження процесів, що відбуваються в амперометричній комірці при подачі статичного потенціалу різних значень. Керування зміною потенціалу здійснюється в ручному режимі;

- метод "cyclic voltammetry" – дослідження процесів, що відбуваються в амперометричній комірці при значенні та напрямку потенціалу, що змінюється циклічно (зняття вольтамперної залежності).

Рамка "Диапазоны" використовується для установки і відображення діапазонів вимірювання. Передбачено 4 діапазони вимірювання струму:

- від 0 до 20 нА, від 0 до 200 нА, від 0 до 2 мкА, від 0 до 20 мкА.

Потрібний діапазон відзначається точкою.

Дана програма може обслуговувати інформаційно-вимірювальні системи із декількома вимірювальними модулями. Рамка "N модуля" використовується для установки номерів (адрес) модулів, що активізуються. Рамка "N модуля" разом із кнопкою перемикання "Канал/Модуль" дозволяє змінювати конфігурацію системи: підключати або канали одного з модулів, або перші канали всіх підключених модулів.

Рамка "Время скан." використовується для установки інтервалу часу між двома сусідніми сеансами обміну даними ПК із модулями, що використовуються. Границі зміни часу сканування залежать від особливостей методів і режимів вимірювання тих або інших величин, зокрема, від необхідної точності результату вимірювання, оскільки для кожного випадку існує час, необхідний для одержання достовірного результату вимірювання, що залежить від рівнів сигналів і завад, а також інших факторів. Для конкретних методик вимірювань вказується час сканування, що рекомендується.

Установка напруги U_уп для керування потенціалом "E" вимірювальної комірки проводиться шляхом посилки відповідного коду керування при кожному обміні даними між ПК і вимірювальним блоком.

Програмне забезпечення надає можливість задавати U_уп для різних методів амперометричних досліджень.

Передбачено 2 види керуючих напруг:

- статичний (метод "amperometric detection") - ручне керування потенціалом;

- напруга із значеннями і напрямком, що змінюються циклічно (метод "cyclic voltammetry").

При статичному виді U_уп значення потенціалу задається оператором вручну, причому, ці значення можуть бути довільними в діапазоні ± 2 В.

При циклічно змінній U_уп оператором задаються: початкове і кінцеве значення потенціалу, дискретність зміни потенціалу, швидкість наростання потенціалу і число циклів зміни потенціалу. Початкові й кінцеві значення можуть перебувати або в позитивній області зміни потенціалу, або у негативної, або забезпечувати зміну потенціалу від негативного значення до позитивного в діапазоні ±2 В. Дискретність зміни потенціалу і швидкість наростання потенціалу взаємозалежні і залежать від часу одержання достовірного результату вимірювання, обумовленого швидкодією вимірювального каналу модуля. Програмою розраховується або дискретність зміни потенціалу при фіксованій швидкості наростання потенціалу, або швидкість наростання потенціалу при фіксованій дискретності. При цьому незмінним параметром є час вимірювання, з яким зв’язане мінімальне значення інтервалу сканування. Відзначимо, що при підвищенні чутливості вимірювального каналу час вимірювання може зростати, що, у свою чергу, призводить до зниження максимальної швидкості зміни потенціалу або до збільшення дискретності цієї зміни.

Після запуску вимірювань значення потенціалу автоматично змінюється від початкового значення до кінцевого із кроком, рівним установленій дискретності зміни потенціалу. Потім змінюється напрямок зміни потенціалу і сигнал змінюється від кінцевого значення до початкового, після чого знову змінюється напрямок зміни потенціалу.

Діалогове вікно для керування значенням потенціалу в статичному режимі (метод "amperometric detection") представлене на рис. 8

Вікно містить:

- текстове поле "E_begin" - для вводу значення потенціалу;

- текстове поле "interval" - для вводу інтервалу опитування вимірювальних каналів;

- текстове поле "t_run" - для вводу часу вимірювання;

- рамку "Режим измер" - керування режимом вимірювання;

- кнопку "Пуск" - ініціює виконання зазначених команд.

Рис. 8. Діалогове вікно для керування значенням потенціалу в статичному режимі

У текстовому полі "E_begin" встановлюється значення потенціалу, що може приймати будь-яке значення в діапазоні ± 2 В.

Текстове поле "interval" призначене для керування періодичністю опитування вимірювальних каналів і встановлює час сканування одного каналу, тобто інтервал часу між двома сусідніми сеансами обміну між модулем і комп'ютером.

Текстове поле "t_run" призначено для введення часу вимірювання при встановленому значенні потенціалу.

Рамка "Режим измер" містить кнопки вибору для керування режимом вимірювання. Передбачено разовий і безперервний режими вимірювання. Потрібний режим відзначається крапкою. При разовому режимі здійснюється однократне вимірювання. При безперервному режимі вимірювання сеанси обміну між модулем і комп'ютером здійснюються безупинно протягом установленого часу "t_run" з періодичністю, обумовленою часом сканування.

Кнопка "Пуск" ініціює запуск встановленої програми обміну між модулем і комп'ютером.

Діалогове вікно для керування значенням потенціалу в циклічному режимі (метод "cyclic voltammetry") представлене на рис. 9.

Вікно містить:

- текстове поле "E_vtx1" - для введення початкового значення потенціалу;

- текстове поле "E_vtx2" - для введення кінцевого значення потенціалу;

- текстове поле "E_step" - для введення кроку (дискретності) зміни потенціалу; (0,02 В)

- текстове поле "scanrate" - для введення швидкості зміни потенціалу (0,1 В/с);

- текстове поле "N_scan" - для введення числа циклів вимірювання;

- мітку "Кол. отсчетов = " - для відображення числа вимірювань при одному значенні потенціалу.

Рис. 9. Діалогове вікно для керування значенням потенціалу в циклічному режимі

У текстових полях "E_ vtx1" й "E_ vtx2" установлюються початкове і кінцеве значення потенціалу відповідно, які можуть приймати значення в діапазоні ±2В за умови, що E_ vtx1 завжди менше E_ vtx2 (алгебраїчно).

Текстове поле "E_step" призначено для введення кроку (дискретності) зміни потенціалу. Мінімальне значення (один дискрет) 0,002 В.

Текстове поле "scanrate" призначено для введення швидкості зміни потенціалу.

Як указувалося, між швидкістю наростання потенціалу, кроком зміни потенціалу і часом одержання достовірного результату вимірювання виникає взаємозв'язок. У зв'язку із цим програмою розраховується або дискретність зміни потенціалу при фіксованій швидкості наростання потенціалу (при введенні "scanrate"), або швидкість наростання потенціалу при фіксованій дискретності (при введенні E_step).

1. Порядок виконання вимірювань:

1. Ознайомитись з роботою програми Potenst_M19.

2. Підключити інформаційно-вимірювальний модуль до ПК.

3. Занурити амперометричну комірку у дистильовану воду, провести вимірювання залежності I=f(U) в циклічному режимі. Встановити E_ vtx1=0 В; E_ vtx2=1,5 В; швидкість зміни потенціалу 0,02 В/с

4. Додати 0,25 мл (або 10 одиниць на інсуліновому шприці) 3% розчину перекису водню у комірку. Розрахувати відповідну молярну концентрацію перекису водню, з урахуванням об’єму та процентного складу розчину. Провести вимірювання залежності I=f(U) в циклічному режимі.

5. Занурити амперометричну комірку у дистильовану воду, провести вимірювання в статичному режимі (U=0.2 B).

6. Додати 0,25 мл (або 10 одиниць на інсуліновому шприці) 3% розчину перекису водню у комірку. Провести вимірювання.

7. Тричі повторити 7, при цьому концентрація розчину, в якому відбувається вимірювання, буде щоразу збільшуватися.

8. Провести вимірювання залежності I=f(U) в циклічному режимів отриманому розчині.

9. Повторити вимірювання (3-7) для перетворювача з іншою площею електродів.