Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

в) Осаждение белков реактивами на алкалоиды.

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ

Реакции осаждения белков в зависимости о применяемого

осадителя бывают необратимыми и обратимыми.

 

Необратимое осаждение белков (денатурация)

 

Необратимые реакции осаждения приводят к денатурации

белков, при этом разрушается пространственная структура

молекулы и белки утрачивают свои естественные биологические и

физико-химические свойства. Денатурацию белков можно вызвать

физическими воздействиями (кипячение, замораживание, высокое

давление, вибрация, радиоактивное излучение и др.) и

химическими осадителями.

Ход работы.

1. Осаждение белков неорганическими осадителями.

А) Осаждение белков минеральными кислотами.

В пробирку осторожно наливают около 1 мл

концентрированной азотной кислоты. Затем, наклонив пробирку,

медленно по стенке добавляют 1 мл 1% раствора белка. На границе

двух жидкостей появляется осадок в виде белого кольца.

Такую же реакцию проделывают с концентрированной

соляной и серной кислотами.

Б) Осаждение белков солями тяжелых металлов.

В три пробирки наливают по 1 мл 1% раствора белка и

добавляют по 3-4 капли: в первую пробирку - 7% раствора

сульфата меди, во вторую - 5% раствора ацетата свинца, в третью -

5% раствора серебра. Во всех пробирках образуется осадок.

 

2. Осаждение белков органическими осадителями.

 

А) осаждение белков органическими кислотами.

 

В 2 пробирки наливают по 2 мл 1% раствора белка и

добавляют в одну пробирку 4-5 капель 10% раствора

сульфосалициловой кислоты, в другую - 5-10 капель 10%

трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

 

Б) Осаждение белков органическими растворителями.

К 1 мл 1% раствора белка добавляют 2 мл органического

растворителя (96% этанола, хлороформа, ацетона или эфира) и

перемешивают. Образование осадка можно усилить добавлением

нескольких капель насыщенного раствора хлорида натрия.

 

в) Осаждение белков реактивами на алкалоиды.

В три пробирки наливают по 1 мл 1% раствора белка, по 4-5

капель 1% раствора уксусной кислоты и по 2-3 капли: в первую

пробирку - 10% раствора пикриновой кислоты, во вторую -

насыщенного раствора танина, в третью - 5% раствора железисто-

синеродистого калия. Наблюдают выпадение осадка. 14

 

 

3. Осаждение белков при нагревании.

 

В пять пробирок наливают по 0,5 мл 1% раствора яичного

белка.

Содержимое первой пробирки нагревают до появления

опалесценции (помутнения раствора).

К раствору белка во второй пробирке осторожно добавляют 1

каплю 1% раствора уксусной кислоты, нагревают и наблюдают

вначале появление опалесценции, а затем выпадение белого

хлопьевидного осадка белка. Это объясняется тем, что белок

теряет заряд и находится в изоэлектрическом состоянии.

К раствору белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10%

раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок не образуется, так

как в кислой среде частицы белка перезаряжаются и приобретают

положительный заряд.

К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 1-2 капли

10% раствора уксусной кислоты, 1 каплю насыщенного раствора

хлорида натрия и нагревают. Выпадает осадок вследствие

адсорбции ионов электролита (образование двойного

электрического слоя) и нейтрализации заряда на частицах белка.

К раствору белка в пятой пробирке добавляют 1 каплю 10%

раствора гидроксида натрия и нагревают. Осадок не образуется,

так как в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка

усиливается.

 

Обратимое осаждение белков (высаливание)

 

При добавлении к водным растворам белков сульфатов или

хлоридов щелочных и щелочно-земельных металлов (Na2SO4,

NaCl, MgSO4 и др.) происходит дегидратация и нейтрализация

белковых частиц, при этом белки выпадают в осадок без

изменения нативной структуры. Такой тип осаждения белков

называется высаливанием. Высаливание - обратимый процесс, и

после удаления соли (разбавлением водой, диализом) белок вновь

приобретает природные свойства. Поскольку разные белки

высаливаются при различных концентрациях солей, этот метод

используется для фракционирования белков. Для разделения

белков методом высаливания широко применяется сульфат

аммония. 15

Фракционное осаждение белков плазмы крови

сульфатом аммония.

Фибриноген выпадает в осадок при 33% насыщении плазмы

сернокислым аммонием, глобулины - при полунасыщении а

альбумины - при полном насыщении.

Ход работы.

1. К 2 мл плазмы крови добавляют 5 мл дистиллированной

воды, 3,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония и

перемешивают. В осадок выпадает фибриноген (можно наблюдать

лишь незначительное помутнение), который отделяют

фильтрованием. Наличие белка на фильтре проверяют биуретовой

реакцией: для этого воронку с фильтром переносят в чистую

пробирку и на фильтр наливают 1 мл 10% раствора гидроксида

натрия и 1 каплю 1% раствора сульфата меди. Фильтрат (№1)

используют для дальнейшей работы.

2. К 4 мл фильтрата №1 добавляют 4 мл насыщенного

раствора сульфата аммония и перемешивают. В осадок выпадают

глобулины, которые отделяют фильтрованием. Получают осадок, с

которым проделывают биуретовую реакцию, и фильтрат №2.

3. К фильтрату №2 добавляют при постоянном пере-

мешивании стеклянной палочкой кристаллический сульфат

аммония до насыщения (пока соль не перестанет растворяться).

Выпадают в осадок альбумины, наличие которых проверяют

биуретовой реакцией: 1 мл смеси переносят в чистую пробирку,

добавляют 1 мл 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1%

раствора сульфата меди.

 

1. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ

(на обнаружение пептидных связей в белках)

Белки (пептиды) в щелочном растворе в присутствии солей

меди (II) образуют комплексные ее соединения, окрашенные в

сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет.

Для пептидной (амидной) группы характерна лактам-

лактимная таутомерия:

В щелочной среде преобладающая лактимная (енольная)

форма полипептида взаимодействует с медью с образованием

стабильного окрашенного комплекса:

Ход работы. К 1 мл 1% раствора белка (желатина, яичного

белка или сывороточного альбумина) добавляют 1 мл 10%

раствора щелочи (NaOH или KOH) и 1 каплю 1% раствора

сульфата меди. Появляется сине-фиолетовое или красно-

фиолетовое окрашивание.

 

КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ

(на ароматические аминокислоты) 4

При нагревании с концентрированной азотной кислотой белки

дают желтое окрашивание. Реакция обусловлена наличием в

белках циклических аминокислот (фенилаланина, тирозина и

триптофана) и основана на образовании нитропроизводных этих

аминокислот, имеющих желтую окраску:

Нитропроизводные аминокислот в щелочной среде образуют

соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет:

Ход работы. К 1 мл 1% раствора альбумина или яичного белка

прибавляют 5 капель концентрированной азотной кислоты.

Появляется осадок. При осторожном нагревании смесь

окрашивается в желтый цвет. После охлаждения осторожно

добавляют 10 капель концентрированного раствора аммиака (или

30% раствора едкого натра), при этом желтая окраска переходит в

оранжевую.

Проделать ксантопротеиновую реакцию с ароматической

аминокислотой, взяв вместо раствора белка 0,1% раствор

тирозина.

Ксантопротеиновая реакция не идет с белками, не

содержащими циклических аминокислот (клупеином, сальмином,

желатином). Проделать реакцию с 1% раствором желатина.

 




Поиск по сайту:

©2015-2020 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.