Состав питательной среды

Лабораторная работа 1

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ БИОСИНТЕЗА

ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ПОВЕРХНОСТНОМ

КУЛЬТИВИРОВАНИИ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ

Цель работы: изучить влияние состава питательной среды на биосинтез лимонной кислоты при культивировании микроскопических грибов Aspergillus niger.

Теоретические предпосылки

Лимонная кислота СН₂СООН–СОНСООН–СН₂СООН является трехосновной гидроксикислотой, кристаллизующейся из водных растворов с одной молекулой воды в виде бесцветных прозрачных кристаллов. Производство лимонной кислоты основано на культивировании микроскопических грибов Aspergillus niger, которые сбраживают сахара питательной среды, образуя лимонную кислоту. В качестве углеродсодержащего компонента питательной среды используют мелассу, содержащую 45 – 48 % сахарозы. Кроме того, в состав питательной среды входят нитрат аммония, моно- или дифосфат калия, сульфат магния, цинка, железа.

Культивирование продуцента проводят поверхностным или глубинным способом. Производство лимонной кислоты включает следующие основные технологические стадии: получение посевного материала, подготовку мелассы к сбраживанию, сбраживание растворов мелассы в лимонную кислоту с последующим отделением мицелия, выделение из сброженных растворов лимонной кислоты и получение ее в кристаллическом виде.

В лабораторной работе изучается влияние концентрации мелассы в питательной среде на процесс накопления лимонной кислоты микроскопическими грибами. Биохимическая активность культуры Aspergillus niger оценивается гравиметрическим (по массе мицеллиальной пленки), титриметрическим (по объему щелочи, пошедшей на титрование культуральной жидкости) и потенциометрическим (по изменению кислотности среды в процессе культивирования) методами.

Для оценки биохимической активности используют следующие показатели:

1) содержание лимонной кислоты в 1 мл культуральной жидкости

x = (0,007×a)/b (1.1)

где a – число мл 0,1 н раствора NаОН, пошедшего на титрование; b – число мл культуральной жидкости, взятой на титрование; 0,007 – количество грамм лимонной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н раствора NаОН;

2) выход лимонной кислоты в процентах от исходного сахара

y = (x × Vкж /c) × 100% (1.2)

где Vкж – объем культуральной жидкости, мл; с – содержание сахара в исходной питательной среде, г;

3) продуцирующая способность культуры

П = (х × Vкж)/m (1.3)

где m – масса мицеллиальной пленки, г;

4) рН исходной питательной среды и культуральной жидкости.

Порядок выполнения работы

1. Приготовить жидкую питательную среду в конической колбе из компонентов по одному из вариантов, указанных в табл. 1.1.

Таблица 1.1.

Состав питательной среды

Взвесить на технических весах пустой стаканчик, поместить в него необходимое количество мелассы, навеску перенести в коническую колбу, смывая остатки мелассы со стенок и дна стаканчика указанным в таблице количеством воды, затем добавить в колбу мерным цилиндром 10 мл раствора солей.

2. Измерить кислотность питательной среды рН-метром. Для этого включить прибор в сеть; промыть электроды дистиллированной водой, просушить фильтровальной бумагой и опустить в стаканчик с питательной средой; установить переключатель вида компенсации (КТ-Р) в положение "КТ"; переключатель вида измерения (рН, °С, mV) установить в положение "рН"; после установления показаний считать результат измерения.

3. Перелить питательную среду из стаканчика рН-метра в коническую колбу; закрыть колбу ватной пробкой и бумажным колпачком, подписать и стерилизовать 15 мин при 1 атм. в автоклаве.

4. Внести в остывшую до температуры 30°С питательную среду посевной материал. Для этого в пробирку с культурой Aspergillus niger на сусло-агаре залить стерильную воду до верхнего края косяка. Проводя бактериологической петлей по поверхности косяка, перенести в воду часть темного конидиального слоя. Полученную водную суспензию конидий перемешать, отобрать стерильной пипеткой 0,5 мл и вылить в колбу со стерильной средой. Поместить колбу в термостат с температурой 30°С на семь суток.

5. Изучить биохимическую активность культуры. Для этого отделить мицелий от культуральной жидкости фильтрованием и определить массу мицеллиальной пленки взвешиванием на технических весах. Измерить объем культуральной жидкости мерным цилиндром, измерить рН культуральной жидкости рН-метром. Определить содержание лимонной кислоты в культуральной жидкости путем титрования щелочью: поместить пипеткой 2 мл фильтрата в коническую колбу; добавить мерным цилиндром 200 мл дистиллированной воды, 3-4 капли фенолфталеина и титровать из бюретки 0,1 н NaOH до слабо-розовой окраски.

6. Рассчитать содержание лимонной кислоты в 1 мл культуральной жидкости по формуле (1.1), выход лимонной кислоты в процентах от исходного сахара по формуле (1.2) и продуцирующую способность культуры по формуле (1.3).

Построить графические зависимости этих показателей от концентрации сахарозы в питательной среде.

7. Результаты измерений и расчетов свести в табл. 1.2.

Таблица 1.2.

Поиск по сайту: