Електрофорез білків на папері

Принцип фракціонування (електрофорезу) заснований на тому, що в електростатичному полі білки рухаються по змоченою буферним розчином хроматографічному папері (ацетатцеллюлозной плівці, крахмаловому, агаровому гелям) зі швидкістю, що залежить в основному від величини електричного заряду та молекулярної маси частинок. Внаслідок цього білки поділяються на фракції. При обробці барвниками білки зв'язуються з ними пропорційно своєї концентрації. Визначивши інтенсивність фарбування, можна обчислити концентрацію білкових фракцій.

Система для електрофорезу. Блок живлення повинен давати стабілізований струм силою 2-100 мА при напрузі 180— 300 В.

Електрофоретична камера. Для запобігання смуги носія від висихання в камері повинна підтримуватися певна вологість повітря. При нагріванні паперу посилено випаровується буферний розчин у середині смуги і з країв стрічки, що обумовлює його рух (реофорез) і внаслідок цього зміна форми плям фракцій білків у процесі їх электрофоретического поділу; тому окремі конструкції электрофоретических камер розташовують системою охолодження смужок носія.

У різних відділах камери буферний розчин повинен мати однаковий рівень, щоб уникнути його переливу через стрічку в результаті сифонового дії. Кінці смужок носія не слід занурювати в буферний розчин, в якому знаходяться електроди. Електричну зв'язок між стрічками і електродами встановлюють за допомогою містків з паперових смужок (вати, марлі), змочених буферним розчином; цим усувається передача змін рН буфера в той простір, в яке занурені стрічки.

Оскільки смуга ацетатцеллюлозной плівки (паперу) може бути розташована як горизонтально, так і під кутом до горизонталі (вертикально), відповідно розрізняють горизонтальний і вертикальний електрофорез. Перший з них дозволяє отримати більш точні результати. Важливо, щоб смужка носія (хроматографічного паперу, ацетатцеллюлозной плівки) була добре натягнута. Бажано, щоб вона розташовувалася як би в «підвішеному» стані, підтримувана вертикально розташованої перегородкою, системою натягнутих капронових ниток, а зв'язує обидві ванни місток мав шипи для укладання на них смужок. Це запобігає утворення тонкого капілярного шару буферного розчину між смужкою ацетатцеллюлозной плівки, хроматографічного паперу і пластиною; капілярний шар буферного розчину в значній мірі погіршує якість электрофоретичного поділу.

Велике значення мають властивості носія, використовуваного для електрофорезу. Ацетатцелюлозних плівка, як і хроматографічний папір, повинна бути однорідною і щільною. Оскільки в окремих лабораторіях все ще використовують хроматографічну папір, щодо її як носія необхідно зазначити наступне.

Обраний сорт паперу: «хроматографічний швидка» або «хроматографічний повільна» — не можна міняти, так як від цього в певній мірі залежать одержувані результати. Якщо хроматографічний папір підлягає денситометрії, то рекомендується швидко поглинається сорт, в інших випадках краще користуватися папером для повільного всмоктування (марки «М»). Папір марки «М» має гладку лицьову і рубчасту зворотну сторони. При уважному розгляді зворотного боку можна помітити грубі і великі штрихи, що йдуть паралельно довшій стороні аркуша. Ці штрихи відображають хід волокон целюлози. Застосовуються для електрофорезу паперові смужки розміром 3,5 х 40 см (або іншого формату, відповідного габаритами електрофоретичної камери), нарізають таким чином, щоб волокна целюлози йшли вздовж смужок. Завдяки цьому кожна смужка паперу являє собою систему поздовжньо йдуть капілярів, що сприяє просуванню білків та інших речовин) і перешкоджає розтіканню до краях смужки. Крім того, отримана стрічка, на відміну від аналогічної з поперечним ходом волокон целюлози, менше деформується при зволоженні і висиханні.

Напрямок ходу волокон целюлози в папері можна визначити і за розтіканню на неї краплі води, що приймає форму еліпса, довгошерстий якого відповідає поширенню волокон целюлози.

Підготовка до електрофорезу та процедура його проведення. Перед електрофорезом камеру встановлюють строго горизонтально. Кювети заповнюють буферним розчином таким чином, щоб рівень рідини в них був однаковий. Обидва відділення кожній кювети з'єднують один з одним смужкою фільтрувального паперу. Смужки ацетатцеллюлозной плівки (хроматографічного паперу) рівномірно натягують між кюветными відділеннями. Необхідно, щоб кінці зволожених буфером смуг (мембран) були занурені в буферний розчин внутрішніх відділень (якщо такі є) електродних кювет.

Найкращі результати дає метод просочування хроматографічного паперу буферним розчином. Однак на практиці в цілях економії часу стрічки зазвичай змочують у буфері і злегка висушують, віджимаючи між листами фільтрувального паперу.

Нанесенняна смужку носія біологічного матеріалу здійснюється за допомогою аплікатора (спеціального або імпровізованого) або мікропіпетки (автоматичною, звичайною).
Буферні розчини. На електрофоретичне фракціонування білків великий вплив має рН буферних розчинів, склад і концентрація складових їх реагентів, так як від кислотності (лужності) середовища, іонної сили буферної суміші й деяких інших факторів багато в чому залежать знак і величина електричного заряду молекул білків.

В якості електроліту найчастіше застосовують веронал-мединаловый, веронал-ацетатний, мединаловый, трис-буфер. Рідше використовують боратный і фосфатний буфер.

Найбільш добре зарекомендували себе такі буферні розчини:

· Вероналовый (веронал-мединаловый) буфер з рН 8,6.

· Веронал-ацетатний буфер з рН 8,6.

· Мединаловый буфер з рН 7,6.

· Трис-буферу з рН 8,9 (дуже добре розділяються білки сироватки крові (з виділенням до 9 фракцій) при використанні трис-буферу з рН 8,9).

· Калій-фосфатний буфер рН8.0 -8.3

Для фарбування электрофореграм сухі паперові стрічки або зволожені буферним розчином плівки кладуть в розгорнутому вигляді на дно плоских емальованих кювет і обережно, повільно доливають або розбризкування розчину барвника. В процесі обробки реагентами электрофореграммы не можна накладати один на одного і згортати.

Фарбувальні реагенти.Основним їхнім компонентом є індикатори (бромфеноловый синій, кислотний синьо-чорний, амидо чорний 10 та деякі інші), що представляють собою барвники, які характерно зв'язуються з білком.
Нінгідрин - органічна сполука, що відносяться до класів кетонів, спиртів і конденсованих карбоціклов. Призматичні кристали білого або жовтого кольору, при нагріванні розчиняється у воді. Нінгідрин використовується як якісний і кількісний реактив при визначенні первинних амінів і амінокислот. 2% розчин Нінгідрин в етиловому спирті або ацетоні використовується в криміналістиці для виявлення слідів папілярного узору на пористих поверхнях, наприклад на папері. Амінокислоти відкривають кольоровою реакцією з нингидрином. У присутності амінокислот або амінів виникає синє, фіолетове або червоне пляма або кільце. Реакцію дають всі амінокислоти (крім проліну і оксипролін).

Під час досліду ми використовували електрофорез на папері, методика якого буде описана нижче.

РОЗДІЛ II. МАТЕРІАЛИ, МЕТОДИ ТА ОБЛАДНАННЯ

2.1. Приготування розчину білку

Для досліду необхідно спочатку відділити білок курячого яйця від жовтка. Потім білок необхідно гомогенізувати, тобто розмішати.

Для досліду був використаний яєчний білок концентрацією 0,1%. Для цього спочатку відміряємо 1 мл 100% яєчного білку мірною пробіркою і доводимо до мітки 10 дистильованою водою. Отримали 10% розчин білку. Потім відмірюємо 1 мл 10% розчину і отримуємо розчин потрібної концентрації.

Робочі розчини необхідно зберігати у холодильній камері.

2.2. Приготування буферного розчину

Для проведення електрофорезу необхідний буферний розчин певного значення рН. Буферний розчин необхідно наливати в ванночки з електродами. Також буфер необхіден для змочення полосок фільтрувалного (хроматогрофічного) паперу з досліджуваним розчином перед внесення в камеру електрофореза.

Для досліду ми використовували фосфатний буфер зі значенням рН 8.0. Саме данне значення рН є оптимальним для проведення досліду з розділення білків яйця на фракції.

Спочатку готують два розчини:

1 - 1,78 г Na₂HPO₄ і розводять дистильованною водою до 200 мл.

2 - 1,36 г KH₂PO₄ в 200 мл дистильованної води.

Для приготування фосфатного буфера рН 8.0 додають в колбу 189 мл першого розчину та 11 мл другого розчину.

2.3. Прилад для електрофорезу

Для проведення електрофорезу був використаний власноруч зібраний прилад.

В основу апарата входить ванна з товстого скла, в яку поміщають дві ванни з електродами - анодна та катодна. Між двома кюветами розміщується пластинка, яка необхідна для розміщення та закріплення полосок фільтрувального або хроматографічного паперу. Електроди найчастіше використовують платинові або вугільні. Ми в експерименті використали пластинки з латуні. З зовнішньої сторони ванночки закріплюють сам електрод, з внутрішньої сторони поміщають кінці полосок фільтрувального паперу, на які наноситься досліджуваний розчин. Кювети заповнюють буферним розчином (фосфатним, боратним, вероналовим) з певним значенням рН та іонної сили. Необхіден однаковий рівень буферу у ванночках з електродами.

В сам апарат входить джерело постійного струму, стабілізатор, випрямляч струму. Для проходження електрофорезу необхідні певні значення напруги та сили струму. Для цього в комплект приладу додається вольтметр і амперметр відповідно. В апараті під час досліду було використане джерело постійного струму Б5-50.

2.4. Методика проведення досліду

Якщо на смужку фільтрувального паперу нанести розчин білку, то після електрофорезу при рН 8.0 протягом 1-2 годин і подальшим фарбуванням електрофореграмми можна спостерігати розділення білків у вигляді окремих смуг. Рух білків відбувається від катода до анода.

Реактиви:

а) розчин яєчного білку

б) фосфатна буферна система зі значенням рН 8.0 та іонною силою 0,05

в) нінгідрид, 0,2% розчин в етиловому спирті.

В обидві ванночки апарату наливають фосфатний буфер. На перегородки між пластинкою та ванною з електродами кладуть смужку фільтрувального паперу. Однаковий рівень буферу в ванночках досягають завдяки мірному посуду (піпеток або мірних пробірок). Смужку фільтрувального паперу (найкраще брати смужки фільтрувального паперу) розміром 1,5-2Х20 см беруть двома пінцетами (для запобігання забруднення), поміщають на лист паперу і в центрі наносять 0,02 мл смужку досліджуваної рідини. Смужки змочують буферним розчином (в чашці). Надлишок вологи видаляють розкладаючи смужки на фільтрувальний папір. Далі смужки переносять на пластинку приладу, так, щоб кінці були у ванночках. Смужки повинні лежати горизонтально.

Зажими електродів фіксують у випримлячі струму - стабілізаторі та джерелі постійного струму. Випрямляч підключать до електромережі і поступово підвищуть напругу. Електрофорез проводять при напрузі 200 В і силі струму 1.5-2мА протягом 1-2 годин, після чого знижують напругу і вимикають прилад.

Смужки електрофореграм виймають чистими пінцетами і з кінців, які були занурені в буферний розчин, видаляють надлишок вологи фільтрувальним папером. Полоски закріплють в горизонтальному положенні і поміщають в сушильну шафу при температурі 100-105^оС протягом 10-15 хвилин. Сухі смужки виймають з шафи і оприскують розчином нінгідрину, після чого для проявлення плям знову помущають в сушильну шафу на 3-5 хвилин.

РОЗДІЛ III. РЕЗУЛЬТАТ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ, ЇХ АНАЛІЗ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Смужка хроматографічного паперу, яка використовувалася для дослідження довжиною складає 15 см.

Після проявлення смужки розчином нінгідрину у спирті на ній з'явилися плями синьо-фіолетового кольору. Це свідчить про наявність руху білків під дією електричного струму.

Після остаточного висихання добре видними стали декілька плям.

На відстані 1,5 см спостерігаємо першу пляму. На відстані 3,5 см спостерігаємо 2 пляму. Третя пляма - на відстані 5 см. Четверта - 8,5 см. П'ята, досить нечітка пляма, слабо проглядається на відстані 14,5 с

Перелік білків яєчного білка:

· Овальбумін

· Овотрансферрін

· Лізоцим

· Овомукоід

· Овомуцін

· Овоглобуліни

Згідно до рисунка 1 можна стверджувати, що овальбумін залишається ближче до катода.

Глобуліни α та β знаходяться посередині Овоглобуліни проходять далі до анода.

Лізоцим найчастіше розташований на відстані близько 3-4 см від катоду.

Згідно з результатами можна сказати, що перша пляма - альбумін, друга - лузоцим. Третя на відстані 5 см та четверта на відстані 8,5 см представлена α₂ та β глобулінами відповідно. Пляма, яка знаходиться на відстані 14,5 см та близько до анода - овоглобуліни. Інші групи білків еспериментально виявлені не були. Згідно інтенсивності фарбування можна зробити висновок, що найбільше у розчині альбмінів.

ВИСНОВКИ

1. Для досліду був використаний яєчний білок концентрацією 0,1%.

Для отримання білку у чистому вигляді його спочатку відділяють від жовтка. Далі готують робочий розчин певної концентрації. Для цього спочатку відміряємо 1 мл 100% яєчного білку мірною пробіркою і доводимо до мітки 10 дистильованою водою. Отримали 10% розчин білку. Потім відмірюємо 1 мл 10% розчину і отримуємо розчин потрібної концентрації.

2. Електрофорез(від електро- та грец. Φορέω - «переношу») - це електрокінетичнt явище переміщення частинок дисперсної фази в рідкому або газоподібному середовищі під дією зовнішнього електричного поля. Під час експерименту був обраний метод електрофорезу на папері.

Принцип цього методу заснований на тому, що в електростатичному полі білки рухаються по змоченою буферним розчином хроматографічному папері зі швидкістю, що залежить в основному від величини електричного заряду та молекулярної маси частинок. Внаслідок цього білки поділяються на фракції, які можна прослідкувати пофарбувавши смужки паперу, наприклад розчином нінгідрину у спирті. На папері видно смуги фіолетового кольору. При обробці барвниками білки зв'язуються з ними пропорційно до своєї концентрації. Визначивши інтенсивність фарбування, можна обчислити концентрацію білкових фракцій.

3. До складу білку курячого яйця входять овальбумін, овотрансферрін, лізоцим, овомукоід, овомуцін, овоглобуліни.
Найбільша концентрація овальбумінів та овоглобулінів.

Ми отримали електрофореграми, на яких видно декілька смуг. Найбільш інтенсивно пофарбованою була смуга біля катода, яка представляє собою альбуміни. Дві плями плями: на відстані 5, відстані 8,5 см представлена α₂ та β глобулінами відповідно. Пляма, яка знаходиться на відстані 14,5 см та близько до анода - овоглобуліни.

ВИКОРИСТАНА ЛІТЕРАТУРА

Поиск по сайту: