Протиправцева сироватка. Організація виробництва сироваток

Організація виробництва сироваток

ПЛАН

1. Організаційна структура цеху сироваток.

2. Утримання коней-продуцентів. Фактори, що впливають на вибір продуцентів сироваток.

3. Комплекс специфічної імунізації коней. Грундування, підготовча та гіперімунізація

а) для виробництва протидифтерійних сироваток

б) протиправцевих сироваток

в) сироватка проти гангрени

г) протиботулічних сироваток

4. Техніка кровопускання. Тотальне кровопускання.

5. Протиправцева сироватка

6. Протидифтерійна сироватка

7. Сироватки проти гангрени

1.У наш час виробництва різних сироваток побудовано в основному за однією схемою (рис. 1) і відрізняються деякими особливостями, пов’язаними з профілем підприємства.

Імунізаційне відділення в цілому виконує завдання сироваткової експлуатації коней-продуцентів (до отримання від тварин крові і передачі її у відділенні технічної і хімічної обробки сироватки), а також ветеринарно-санітарного і зоотехнічного їх обслуговування.

Імунізаційне відділення складається з декількох імунізаційних клінік, карантинної імунологічної клініки, ізолятора, клініко-патоморфологічних лабораторій, ветеринарної аптеки. До штату імунізаційного відділення повинні входити ветеринарні лікарі, ветеринарні фельдшери, лаборанти - імунізатори, ветеринарні санітари, робітники по догляду за кіньми–продуцентами, фуражири. Під наглядом ветеринарних лікарів і при їхній особистій участі проводяться всі операції з продуцентами (ін'єкції антигенів, взяття проб крові, лікувальні процедури, вимірювання температури, ветеринарно - санітарні процедури.

Начальник цеху

Імунізаційне відділення Відділення технічної і хімічної

обробки сироваток

Імунізаційні Клініко-патоморфо- Бригада технічної Бригада очищення

клініки логічна лабораторія обробки крові та та концентрування

одержання нативної сироваток

плазми або сироватки

Карантинна імунклініка, ізолятор

ветеринарна аптека

Відділення протидифтерійної Відділення сироватка проти Відділення сироваток проти

і нормальної сироваток правця гангрени

Рис.1. Організаційна структура цеху сироваток.

Відділення технічної та хімічної обробки сироваток одержує імунну і нормальну кров одержують з імунологічного відділення, здійснює її технічну обробку (сепарують або відкачують вручну) до отримання нативної плазми або сироватки. Потім очищають, концентрують, стандартизують, стерилізують фільтрацією і передають у цех розливу та фасування.

Провідні відділення ( протиправцевої, протидифтерійної, протигангренозної та інших сироваток) готують антигени для гіперімунізації коней (у ряді випадків антигени виготовляють відповідні відділення вакцино-анатоксинного цеху), складають схему специфічної експлуатації продуцентів, проводять виробничий контроль напівфабрикатів і готової продукції, здійснюють випуск препаратів до здачі їх на склад, і несуть відповідальність за їх якість.

2. Утримання коней-продуцентів. Коні повинні бути абсолютно здоровими. Після завезенням на підприємство (інститут) їх 45 днів витримують в карантинно-імунологічній клініці. При відсутності протипоказань та закінчення карантинного терміну коней переводять у виробничу імунологічну клініку. Залежно від загального стану тварин починають імунізувати через 21-45 днів, але не раніше 21 дня. Щоб уникнути виникнення і розповсюдження інфекції імунологічні клініки будують по принципу окремих ізольованих секцій у кожній з яких міститься 30 коней. Захворівших коней терміново переводять в ізолятор.

Як відомо, для отримання лікувально-профілактичних сироваток використовується метод гіперімунізації тварин, введення їм наростаючих доз відповідних антигенів з метою домогтися найвищої відповідної імунологічної реакції організму, а разом із тим, максимального збільшення у крові тварини такої кількості специфічних антитіл, яка забезпечила б лікувальну і профілактичну здатність сироватки.

Серед факторів які впливають на процес найбільше значення мають індивідуальні особливості тварин, які використовуються у виробництві сироватки, і створення у них грундімунітету з метою забезпечення попередньої імунологічної перебудови організму, також методи гіперімунізаціі тварин, антигени, які застосовуються при цьому і неспецифічні подразники, а також догляд і годування тварин у період експлуатації. У даний час Кінь, як біологічна модель для отримання гіперімунних сироваток залишається загальновизнаним продуцентом за комплексом показників (висота титрів антитіл, кількість одержуваної крові, її обробка і вихід сироватки), і тільки цей вид тварин в основному використовують для експлуатації у виробничих масштабах. Відбір продуцента для отримання високоактивних лікувальних сироваток вважається складною процедурою, і його проводять за фізіологічними й імунологічними показниками. При цьому частина тварин (50%) вибраковують з числа продуцентів із-за їх слабкої реактивності.

Отримання високоактивних лікувально-профілактичних сироваток пов’язано із породою, конституцією, з віком і статтю тварини. Вік тварин повинен бути 3-5 років. За комплексом показників найкращими продуцентами протиправцевої і протидифтерійної сироваток вважаються кобили, потім - жеребці, і гіршими – мерини. Серед коней імунізованих гангренозними антигенами, кращі показники виявились у жеребців, трохи гірші у кобил і погані у меринів. Краще мерини показали себе як продуценти сироваток проти ботулізму. Їх більше використовують як донорів нормальної крові. Але найбільш теоретично обґрунтованим і практично доцільнішим вважається відбір продуцентів за імунологічними показниками.

3. У комплексі специфічної імунізації коней - продуцентів антитоксичних сироваток можна виділити триосновних процеси, які складаються з віддаленого грундування тварин відповідними антигенами, підготовчих циклів імунізації і наступних виробничих циклів гіперімунізації.

Спроби використати ступінь наростання титру антитоксину в результаті імунного подразника, які передували початку гіперіммунізації виявилися ефективними. Вперше штучний грундімунітет був створений у коней, призначених для виробництва протиправцевої сироватки. Надалі попереднє грундування отримало поширення і при підготовці коней-продуцентів протигангренозних, протиботулічних, протидифтерійної і інших сироваток. Попереднє грундування коней забезпечує підвищення титру специфічних антитіл при наступній гіперімунізації тим же антигеном у 5 разів і більше, підвищує вихід так званих «ділових» продуцентів і створює умови отримання сироваток в більш короткий термін.

Враховуючи великі витрати, пов’язані із забезпеченням коней в підготовчий період, грундування і підготовчий цикл гіперімунізації, а також відбір більш реактивних продуцентів доцільно здійснювати на місці заготовки в господарствах – постачальниках коней. При цьому треба враховувати, що більш віддалене грундування коней забезпечує більш інтенсивне утворення антитіл при наступній гіперімунізації продуцентів. Наприклад ефективне грундування коней правцевим анатоксином у віці 1 - 2 роки з наступним використанням цих тварин в якості продуцентів відповідної сироватки у віці 3-4 років.

а) Комплекс імунізації коней для виробництва протидифтерійних сироваток.

У даний час застосовують різні методи грундування, зокрема коней, призначених для виробництва протидифтерійної сироватки. Наприклад шляхом підшкірного введення двох доз нативного дифтерійного анатоксину (3 і 6 мл ), емульгованого в ланоліні і рослинній олії (2: 1) з інтервалом між ін'єкціями 21 день, або шляхом введення 5 мл сорбованого і 20 мл. нативного анатоксину з інтервалом між ін'єкціями 21 день з одночасною аплікацією мікродоз дифтерійного токсину (4 і 8 Dlm) у тій же послідовності. Через 30 днів (цей період можна збільшити до 6 міс) після грундування коням проводять підготовчий (перший) цикл імунізації шляхом підшкірного введення нативного дифтерійного анатоксина з 1% хлориду кальцію: (використується в якості ад'юванта), але за схемою: 5-10-20-40 - 80-100 -120-150 мл з інтервалом між ін'єкціями 4 - 5 днів. Чергові дози антигену вводять під контролем наростання рівня антитоксина в сироватці крові коня.

До кінця підготовчого циклу титр антитоксину повинен бути не нижче 600 МЕ/мл. Коней, у крові яких не міститься мінімально допустимої кількості антитоксину, вибраковують. Коням з титром 600 МЕ/ мл і вище на 7-й день після введення останньої дози антигену роблять кровопускання і використовують кров для отримання готового препарату. Через 2 тижні після кровопускання, протягом яких коні відпочивають, проводять другий цикл гіперімунізаціі і т. д. У другому та наступних циклах гіперімунізаціі антиген з 1% хлоридом кальцію коням вводять триразово з інтервалом між ін'єкціями 4-5 днів. Схеми введення антигену для кожного продуцента визначають індивідуально залежно від динаміки утворення антитіл у попередніх та даному циклах гіперімунізаціі. У відповідності з цим дози веденого антигена можуть бути малими (20-40-80 мл), середніми (50-100 - 150 мл) і високими (більше 150 мл).

б) Коней, призначених для виробництва протиправцевої сироватки, попередньо двократно грундують нативним правцевим анатоксином з 1 % алюмо - калієвих галунів у дозах 10 мл при першій і 20 мл при другій ін’єкції антигену з інтервалом між ними 21-30 днів. Інтервал між другим грундуванням і підготовчим (першим) циклом гіперімунізації повинен бути не менше 45 днів.

У підготовчому циклі імунізацію проводять нативним правцевим анатоксином за схемою: 5-10-20-40-80-120-150 мл. Інтервал між ін’єкціями витримують 4- 5 днів. Основну вибракування інертних тварин, як правило здійснюють після підготовчого циклу гіперімунізації. Кількість рефрактерних продуцентів зазвичай становить 15 - 25%. У наступних циклах схеми гіперімунізації коней, призначають індивідуально залежно від динаміки накопичення антитоксину в сироватці крові продуцентів у процесі попередньої імунізації. Приблизно вони можуть бути наступними: 40-80-120 мл; 50-100-150 мл; 100-200-300 мл антигена з тим же депонентом, що і в підготовчому циклі. Інтервал між ін'єкціями 4-5 днів. Для гіперімунізації коней - продуцентів протиправцевої сироватки, як правило, використовують нативний правцевий анатоксин і рідше правцевий токсин.

в) Коней, призначених для отримання протигангренозної полівалентної сироватки, попередньо дворазово грундують гангренозним триантигеном, змішаним з ланоліном і олією; інтервал між ін'єкціями 15 днів. Антиген вводять підшкірно в область шиї. Перша ін'єкція 2 мл анатоксину перфрінгенс (250 – 300 Dlm/мл), 1 мл анатоксина едематієнс (3000 Dlm/мл вихідного токсину), 2 мл токсина септикум (250-300 Dlm / мл), 10 мл ланоліна, 5 мл олії (соняшникової або оливкової).

Через 15 днів після другого грундування приступають до першого циклу гіперімунізаціі коней, який складається з 7-8 ін'єкцій антигену в кількості 5-10-20-40-80-100-150-200 мл, з інтервалом між ін'єкціями 4-5 днів. Наступні цикли гіперімунізаціі починають з дози, яка відповідає 1/3 останньої дози антигена попереднього циклу. Всього за цикл, коням вводять 3-4 дози антигену; при цьому співвідношення компонентів у триантигені приблизно повинно бути наступним : анатоксину перфрінгенс- 40% , анатоксину едематієнс - 20%, токсина септикум - 40%.

При виробництві моновалентних протигангренозних сироваток (протиперфрінгенс, протиедематієнс, протисептикум) принцип гіперімунізації коней залишається звичним, але для кожного виду сироваток виділяють особливі групи тварин.

г) Збудник ботулізму називається Cl. botulinum і являє собою групу анаеробних мікроорганізмів, яка об'єднується за ознакою – патологічної дії виділеного ними токсину на тваринний організм. Дана група неоднорідна і включає в себе багато різновидів. За серологічними властивостями токсинів Cl. botulinum поділяють на 6 типів: A, B, C, D, E, F.

При потраплянні будь-якого з цих шести типів токсинів до організму людини або тварини можуть спостерігатись ознаки важкого отруєння з характерною для ботулізму клінічною картиною. За клінікою встановити тип збудника практично неможливо.

Найчастішою причиною ботулізму у людей є отруєння токсинами типів А, В, і Е. У літературі описані поодинокі випадки ботулізму, який викликаний токсинами типів C, D, F.

Проблема активної профілактики ботулізму у людей розроблена достатньо повно і практично вирішена за рахунок створення комплексного (очищеного сорбованого) анатоксину. На даний час імунізація проти ботулізму проводиться лише особам, які мають безпосередній контакт з ботулінічними токсинами (виробництво анатоксинів і сироваток). Для лікування застосовується комплекс заходів, серед яких важливе значення має використання сироваток.

Технологія отримання сироваток. Сироватки проти ботулізму найчастіше отримують від коней. Технологія отримання сироваток складається з підбору продуцентів, приготування антигенів для імунізації, створення у тварин грундімунітету, проведення 3-х підготовчих циклів гіперімунізації і наступного відбору якісних продуцентів для гіперімунізації. Враховуються індивідуальні особливості тварин. Після кожного циклу гіперімунізації через 9-11 днів проводиться кровоспускання з метою отримання імунної плазми або сироватки.

Етапи отримання сироваток проти ботулізму однотипні до тих, які проходять при виготовленні інших антитоксичних сироваток.

Характеристика штамів. У виробництві ботулінічних анатоксинів використовують різні штами, перевірені на типоспецифічність і зареєстровані. Культивують мікроби типу А на казеїново – грибному поживному середовищі при 34-37⁰С протягом 6-7 діб. Через 3 доби інкубації при 34⁰С культуру поміщають в холодильник, де вона зберігається при температурі не вище 4⁰С.

Маточну культуру В штаму підтримують на бульйоні з печінки у флаконах, об'ємом 200мл зі шматочками м'ясного фаршу під шаром вазелінового масла. Культивування проводять протягом 6 діб при 34⁰С.

Для виготовлення токсину С культуру вирощують на кислотно-казеїновому гідролізаті з м'ясним фаршем і 0,5% глюкози 6-7 діб при 34⁰С.

Для отримання токсину Е використовують ємності з бульйоном, м'ясним фаршем, крейдою і ватою на дні. Культивування проводять при 28⁰С. Токсиноутворення досягає свого максимуму на 9-11 добу.

У виробництві анатоксичних сироваток ботулінічний токсин типу F отримують шляхом культивування мікробу на бульйоні з печінки і м'ясним фаршем протягом 6-7 діб.

Коней, призначених для отримання протиботулічних моновалентних сироваток (А, В, С, Е або F) попередньо дворазово грундують відповідним анатоксином При першому грундуванні підшкірно вводять 5 мл антигену в суміші з 10 мл ланоліну і 5 мл рослинної олії , при повторному ( через 21-30 днів) - 10 мл антигена з 15 ланоліна і 10 мл рослинної олії.

Через 45 – 60 днів після грундуваня починають підготовчу гіперімунізацію (до трьох циклів). Однак частина коней може бути переведена в « ділові »продуценти вже після першого або другого підготовчого циклу. Перший підготовчий цикл гіперімунізації проводять за схемою; 5-10-20-40-80-100-120 мл антигена з 1% алюмінієво-калієвих галунів. Відсоткове співвідношення депонента необхідно зменшувати в міру збільшення дози антигена. На 0,5% вміст галунів переходять, коли доза антигена перевищує 100 мл, на 0,25% - коли вона становить 200 мл і вище. Інтервал між ін’єкціями 4 – 5днів. На 7 день після останньої дози антигена виконують перше кровопускання.

7 день прийнято вважати днем найвищої кількості антитіл у крові продуцента. Після кровопускання коней ставлять на відпочинок на 2 тижні і проводять другий підготовчий цикл імунізації. Через 2 тижні після закінчення другого проводять третій цикл гіперімунізації, що складається з 3 ін'єкцій антигену в дозах від 25до50 мл, від 50 до 100мл і від 100 до 150 мл. У наступних циклах водять також по 3 дози антигена.

Для гіперімунізації коней – продуцентів антитоксичних протиботулінічних сироваток, крім анатоксинів широко використовують відповідні токсини. Перехід коней на імунізацію токсином здійснюють після одного або декількох циклів імунізації анатоксином. Зазвичай такий перехід стимулює антитілоутворення. Отримання протиботулічної полівалентної сироватки проводять за таким же принципом, як і отримання моновалентних, але сумішшю ботулінічних антигенів в (А, В, С, Е або А, В, С, Е, F], проти яких необхідно отримувати сироватку.

Техніка кровопускання

По закінченню циклічної імунізації, коли в сироватці крові тварини накопичується максимальна кількість специфічних антитіл, у коня беруть кров. Частіше це роблять на 7-й день після введення продуценту останньої дози антигену. Кількість забраної крові залежить від живої маси коня, звички її до крововтрат (починаючі цикли чи наступні), кількість передбачуваних кровопускань у даному циклі, висоти титру антитіл і стану здоров'я тварини. До взяття крові продуцентів треба привчати поступово. Прийнято у першому циклі брати в коней крові на 30-35% менше, ніж у коней, що уже пройшли 4-5 циклів експлуатації. У другому, третьому та четвертому циклі кількість крові поступово збільшується. На троєкратне кровопускання тварин переводять не раніше ніж з 4-5-го циклу гіперімунізації.

У коней, які звикли до втрати крові кількість забраної крові повинно рівнятися 1/50 живої маси, на кожні 50 кг маси відбирають 1 л крові, що при середній живій масі продуцента 400-500 кг відповідає 8-9 л крові при першому кровопусканні. При другому (через 48 год); беруть на 1 л, а при третьому (через 48 год після другого) -на 2 л менше крові порівняно з першим кровопусканням. Всього коні служать продуцентами гіперімунних антитоксичних сироваток в середньому 20 циклів, або 2 роки.

Кровопускання проводять за допомогою спеціальної голки довжиною 10-12 см, з діаметром отвору 3-4 мм і товщиною стінки не більше 1 мм. На грушовидну основу голки одягають міцну, еластичну резинову трубку довжиною 160- 190 см і з отвором 6-7 мм, в середині якої міститься скляний з’єднувач – контролер, а на кінці – скляна зігнута крючком трубка, вмонтована у ватну пробку, вставлену в 10 л бутель з добавкою в нього антикоагулянтом. Перед кровопусканням коней не годують протягом 10-12 год. і в першу чергу видаляють концентровані корми із вранішньої норми. Таким чином запобігають мутності і загальної хільозності плазми та сироватки. Призначеного на кровопускання коня чистять, вимірюють у нього температуру тіла, заводять у верстат спеціальної операційної. Кров беруть з області шиї з верхньої третини яремної вени. Після кровопускання коня заводять в стайню і відразу дають води.

Техніка тотального кровопускання. Тотальні кровопускання коням роблять тоді, коли на основі загального фізіологічного стану тварин зроблено висновок про недоцільність їх подальшого використання як продуцентів. Після фіксації тварини і підготовки операційного поля розрізають в області шиї сонну артерію, через яку і забирають всю кров. Для отримання більшого об’єму крові коням перед тоталізацією вводять серцеві препарати.

Протиправцева сироватка.

Для отримання правцевого токсину застосовують м'ясні поживні середовища: Легру, Рамона і гідролізоване середовище Глузмана (Ю. А. Козлов, 1950). Середовище Глузмана стерилізують в бутлях при 110° С протягом 30 хв. Після стерилізації в середовище при 35°С засівають 5-10 мл рідкої культури . Культивування проводиться при З5°С протягом 6-8 діб. Токсиноутворення супроводжується газоутворенням. Найбільш інтенсивне розмноження мікроба спостерігається в період між 36 і 72 год інкубації. На дні бутля утворюється осад з мікробних клітин. Правцевий токсин переводять у анатоксин шляхом добавляння в препарат формаліну і витримування суміші в термості 20-25 днів при 39°С до повного знищення мікроорганізмів. Для гіперімунізації коней-продуцентів використовують анатоксини, виготовлені з токсину з активністю 800 000-1600 000 Dlm і вище. Для гіперімунізації коней може бути використаний і правцевий токсин, але після підготовчого циклу, проведеного правцевим анатоксином.

Протиправцеву сироватку одержують шляхом гіперімунізації коней правцевим антигеном (анатоксином або токсином) з наступною її очисткою і концентруванням. Після очищення та концентрування, контролюють фізичні властивості сироватки, стерильність, апірогенність, специфічну активність, нешкідливість, вміст білка, рН, вміст залишкового сульфату амонію. Після виробничого контролю кожна серія сироватки поступає в ВОБК, де контролюють також фізичні властивості, стерильність, специфічну активність після 20 денної витримки при 37°С, апірогенність і рН. Після проведення контролю ВОБК дає дозвіл на розлив сироватки.

Контроль сироватки на піроген. Для виявлення пірогена дослід ставлять на здорових кролях різної статі масою 1,5-2,5 кг, переважно породи шиншила, що утримуються на повному раціоні. Кроликів відбирають по масі за 3 дні до досліду. Кожного кролика садять в окрему клітку. Використану сироватку підігрівають до 37°С і вводять у вушну вену в кількості 1 мл на 1 кг маси кролика, якщо після повторного досліду у 3 або більше з 6 кроликів відзначається підняття температури на 0,8°С і вище, сироватка вважається пірогенною.

Контроль стерильності проводять в асептичних умовах в боксах. Допустимим вважається ріст не більше п’яти колоній сапрофітних мікробів на одній чашці Петрі.

Контроль нешкідливості. Нешкідливість сироватки перевіряють із кожного бутля, які входять до складу серії, на одній морській синці масою 300-400 г, веденням їй підшкірно 10 мл препарату ( по 5 мл в обидва боки). Будь-яка реакція повинна бути відсутня

Визначення активності протиправцевої сироватки

Титрування протиправцевої сироватки засноване на властивості токсину, виділеного збудником, спричиняти смерть мишей і здатності протиправцевої сироватки нейтралізувати ці здатності токсину. Активність сироватки виражають в міжнародних антитоксичних одиницях (МЕ).

Протидифтерійна сироватка

Діючою основою протидифтерійної сироватки служить імунна глобулінова фракція, отримана з крові коней, гіперімунізірованних дифтерійним анатоксином.

Для отримання протидифтерійної сироватки імунізують коней дифтерійним анатоксином. Культуру для його одержання мікроорганізм яку вирощували 2 дні засівають на стерильний бульйон Мартена з 0,2% глюкози і культивують при 34-35°С протягом 7-10 днів. Специфічна активність токсину характеризується двома показниками: специфічною токсичністю, що визначається на морських свинках (Dlm), і антигенною активністю, яка визначається реакцією флокуляції (ЛФ).

Для отримання анатоксину до стерильного фільтрату токсину додають 0,4% формаліну (з розрахунку на 40% розчин формальдегіду). Знезараження проводять в термостаті протягом 30-32 днів при 40°С. Гіперімунізація коней таким анатоксином дає можливість отримати нативні протидифтерійні сироватки з достатньо високим рівнем антитоксину. Нативні сироватки в подальшому очищають та концентрують. Біологічна активність сироваток при зберіганні при 4°С не змінюється довгий час. Готова протидифтерійна сироватка повинна бути стерильною, апірогенною, не шкідливою. Вміст білку не повинно перевищувати 15%, рН має бути в межах 6,9 - 7,2, Мінімально допустимий кількість антитоксину на 0,1 г білка повинно бути це менше 1200 МЕ. Визначення специфічної активності протидифтерійних сироваток засноване на їх здатності нейтралізувати некротичну дію дифтерійного токсину в досліді на лабораторних тваринах. Антитоксичну активність визначають за допомогою реакції флокуляції.

Титрування сироватки реакцією флокуляції.

Титрування протидифтерійної сироватки за допомогою реакції флокуляції засноване на тому, що у суміші токсину або анатоксину з певною кількістю сироватки спостерігають помутніння і випадання рихлого осаду флокуляту (комплекс антиген-антитіло).

Титрування протидифтерійної сироватки проводять токсином (анатоксином), у якому попередньо встановлено вміст антигенних одиниць (ЛФ) у 1 мл. Одну антигенну одиницю (ЛФ) токсину (анатоксину) нейтралізує одна антитоксинова одиниця (1 МЕ) протидифтерійної сироватки. Визначення якості антигенних одиниць у токсині (анатоксині) здійснюють за допомогою стандартної протидифтерійної сироватки. До ряду пробірок розливають різні кількості розведеної стандартної сироватки, наприклад 0,1 0,15-0,2-0,25 мл, і додають по 2 мл токсину або анатоксину. У пробірці з ініціальною флокуляцією міститься стільки ж антигену, стільки й антитоксичних одиниць (МЕ) стандартної сироватки. Якщо, наприклад, ініціальна флокуляція наступила в суміші, де до 2 мл токсину або анатоксину добавлено 0,2 мл стандартної флокуліруючої сироватки, розведеної до вмісту 200 МЕ в 1 мл, то кількість антигенних одиниць токсину або анатоксину в 1 мл буде так само 20.

Визначення дифтерійного антитоксина методом Ремера

Титрування по Ремеру базується на властивості дифтерійного токсину при підшкірному введенні викликати у морських свинок некроз тканині і на здатності протидифтерійної сироватки нейтралізувати цю дію токсину. Для титрування сироваток застосовують дифтерійний токсин, витриманий під толуолом в холодильнику не менше 12 місяців з вититрованою дослідною некротичною дозою Ln/50. Титр протидифтерійної сироватки для випуску визначають, виходячи із найбільшого розведення сироватки, в суміші з якою дослідна доза токсину не дає реакції на місці введення до останнього дня досліду.

Призначення і застосування препарату. Очищена концентрована протидифтерійна сироватка застосовується для специфічної терапії дифтерії. Сироватку вводять у ранній термін захворювання підшкірно та внутрішньом'язово в кількості 5000-15 000 МЕ залежно від тяжкості хвороби. Протидифтерійну сироватку випускають у запаяних ампулах по 5 мл (10000 МЕ) або 10 мл (20000 МЕ). Сироватку зберігають у сухому, захищеному від світла місці при температурі 3-10°С. Термін придатності 2 роки.

ПРОТИГАНГРЕНОЗНІ ТОКСИНИ

Газова гангрена відноситься до раневих інфекцій, викликається спороносними анаеробами, (Cl. perfringens, Cl. oedematiens, Cl. Septicum та ін.) які живуть у грунті. Вперше сироватку проти газової гангрени було отримано Лекленшем і Морелем в 1898 р. від осла шляхом імунізації культурою Сl. septіcum , але на людях вона не була використана. У Радянському Союзі сироватки проти гангрени були виготовлені в 1930 р. І. М. Велікановим. Перше масове застосування цих сироваток в СССР було здійснено в воєнних умовах на озері Хасан і Халхін-Гол. У наш час випускають полівалентну сироватку проти гангрени з високим вмістом специфічних антитоксинів. Полівалентну сироватку отримують шляхом гіперімунізації коней комплексом гангренозних антигенів. Для їх виготовлення використовують високотоксигенні штами збудників газової гангрени, апробованні в ГИСК імені Л.А. Тарасевича. Для отримання токсину перфрінгенс застосовують культуру Cl. рerfrіngens штам 28 ВР 6К, вирощену на м'ясних або казеїнових середовищах. Ріст культури продовжується від 6 до 18 год. при 34-37°С. Джерелом вуглеводів є 0,5% розчин глюкози або декстрину. Культуру сепарують на сепараторі марки АСГ-ЗМ. Для гіперімунізації коней зазвичай використовують концентрований антиген, для чого застосовують метод двократного осадження токсину Cl. рerfrіngens сульфатом амонію. Сульфат амонію попередньо висушують, подрібнюють, стерилізують сухожаровим методом. Осад який містить антиген та інші білки, використовують для отримання другого концентрату. При висолюванні токсину осад розчиняють у дистильованій воді. Отриманий таким чином перший концентрат піддають вторинному осадженню, але при цьому концентрацію солі беруть із розрахунку 42 г на 100 мл першого концентрату. Отриманий осад другого концентрату розчиняють в нативному токсині із розрахунку 1: 15-1: 20.

Розчинений осад антигену центрифугують і піддають стерілізуючій фільтрації, а потім частково знешкоджують 0,3-0,4% формаліном при 37°С протягом 1 доби. Для отримання токсину Cl. оedematіens (штам № 79), культуру, вирощену протягом 2 діб на напіврідкому середовищі, пересівають на кислотний гідролізат казеїну або м'ясне середовище, що містить 0,5% глюкози або декстрину, інкубують в термостаті протягом доби при 37 ° С. Активність токсину при цьому становить 3000-4000 Dlm/мл, а іноді і вище. Токсин фільтрують через паперові фільтри, натерті крейдою або тальком, після чого піддають стерилізуючій фільтрації та знешкодженню 0,4 - 0, 5% формаліну при 37°С протягом 48 год. Отриманий анатоксин додатково витримують 5 діб при. кімнатній температурі, досліджують на нешкідливість, стерильність, зв’язуючу здатність антитоксину потім використовують для гіперіммунізації коней. Зберігають анатоксин при температурі 8°С. Допускається зберігання і при кімнатній температурі.

Для отримання токсину септичного вібріону застосовують культуру С1.septicum, штам № 59, яку вирощують на середовищі із панкреатичного гідролізату казеїну, або на м'ясних середовищах. Для посіву використовують добову культуру, вирощену на напіврідкому середовищі, на якому зберігають штам. До середовища додають 1% глюкози. Вирощують при 37°С протягом 18-20 год (при більш тривалому вирощуванні активність токсину знижується). Отриману культуру фільтрують через стерильні ватно-марлеві фільтри, а потім через стерилізуючі пластини фільтра Сальникова. Допускається сепарування культури. Токсин перевіряють на стерильність, токсикогенну активність і специфічність. Специфічну активність сироваток визначають біологічним методом на білих мишах.

Поиск по сайту: