Микоплазмы –это прокариоты малых размеров, имеют только цитоплазматическую мембрану и не способны синтезировать пептидогликан. Это полиморфные микроорганизмы, по форме представляют собой сферические или грушевидные структуры, а также разветвленные или спиральные нити, как правило, неподвижны. Клетки микоплазм, в отличие от других прокариот, не имеют клеточной стенки. Снаружи ЦПМ находится капсулоподобный слой. Морфологию микоплазм изучают в живом состоянии в фазово-контрастном микроскопе и путем электронной микроскопии ультратонких срезов их клеток. По Граму окрашиваются медленно, грамотрицательны.
Хламидии. (Морфология, жизненный цикл хламидий).
Хламидии - мелкие, чувствительные к антибиотикам бактерии диаметром около 0,2-1,5 мкм, которые развиваются только внутри живых клеток («облигатные внутриклеточные паразиты») н вызывают широкий спектр патологических процессов у человека н животных. Естественный цикл развития хламидий проходит в цитоплазматических включениях живых клеток (элементарное тельце - ретикулярное тельце — ретикулярные тельца - промежуточные тельца - элементарные тельца) и продолжается от двух до трех суток. Завершив цикл размножения, хламидии разрушают цитоплазматические включения, выходят из клетки-хозяина во внешнюю среду и заражают новые клетки.
По современной классификации хламидии относят к роду Chlamidia семейства Chlamidiaceae порядка Chlamidiales. Вид С. trachomatis - возбудитель антропонозных хламидийных инфекций, первично поражающих слизистые оболочки (трахома, урогенитальный хламидиоз, венерическая лимфогранулема); это - один из самых распространенных и наиболее актуальных возбудителей заболеваний, передаваемых половым путем.
Возбудитель венерической лимфогранулемы имеет биологическое отличие от возбудителей других урогенитальных хламидиозов. Он имеет выраженный тропизм к лимфоидной ткани и встречается в Юго-Восточной Азии.
Методы выявления хламидий
Хламидии обычно выявляются в клетках плоского, а не цилиндрического эпителия. Клетки с хламидиями располагаются группами по 4-6 штук; хроматин в них распределен причудливо, грубые его нагромождения чередуются с просветлениями, цитоплазма клетки слегка вакуолизирована. В части случаев хламидии располагаются в виде внутриклеточных элементарных телец. Позднее они становятся крупнее, делаются менее плотными и располагаются внутри крупной вакуоли вблизи ядра. Хламидии чувствительны к тетрациклинам, макролидам и рифампицину, а L-формы бактерий чувствительны к эритромицину и рондомицину.
Хламидии окрашиваются по Романовскому-Гимзе, грамотрицательны, хорошо видны в нативных препаратах при фазово-контрастной микроскопии. Методика окраски по Романовскому-Гимзе.
Методы выявления риккетсий
Риккетсии – грамотрицательные микроорганизмы малых размеров. Они занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. С бактериями они сходны по морфологии. Внутриклеточное размножение и паразитизм на энергетическом уровне сближают их с вирусами. Окисляют глутамат с образованием АТФ.
По величине они крупнее вирусов, не проходят через фильтры и обнаруживаются в оптическом микроскопе.
По П. Ф. Здродовскому наблюдаются 4 морфологических типа риккетсий (циклы развития риккетсии):
1) кокковидные (0,5 мкм),
2) палочковидные (короткие - 1-1,5 мкм),
3) бациллярные (длинные, изогнутые - 3-4 мкм),
4) нитевидные (20-40 мкм).
Риккетсии выявляются в окраске по методу Грама (грамотрицательные), по методу Романовского-Гимзы, по методу Здродовского и нативных препаратах (удобен и прост метод окраски риккетсий по Здродовскому)
Теоретическая справка
к Работе № 2
Техника приготовления препаратов
1. Приготовление мазка
1) с жидкой питательной среды 2) с плотной питательной среды
культуру берут петлей и каплю наносят на предметное стекло наносят
непосредственно на стекло (без воды) небольшую каплю воды, в которой
эмульгируют исследуемый материал
и распределяют на площади около 2 см2
2. Высушивание
на воздухе высоко над пламенем спиртовки
мазком вверх
3. Фиксация
Цель: - прикрепить микробов к стеклу
- обеззаразить патогенные микробы
- убитые микробы лучше окрашиваются
Методы
физическийхимический
- над пламенем спиртовки мазком - более щадящий по сравнению
вверх (3 раза круговыми движениями) с физическим: мазок погружают
в фиксатор (этанол, ацетон, формалин
и др.) на определенное время
4. Окраска
Методы
простыесложные
(ориентировочные) (дифференцирующие)
1) окрашивают одним красителем 1) используют несколько красителей
анилинового ряда - основным или (основная и вспомогательные краски,
Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.
Методика окраски по Граму:
1 этап. Используется основная краска генциановый фиолетовый, затем раствор Люголя. Образуется прочное комплексное соединение «генциановый фиолетовый + йод». Все микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.
2 этап. Обработка этанолом (дифференциация)
одни микробыдругие микробы
сохраняют комплекс генциановый теряют комплекс генциановый
фиолетовый + йод, не обесцвечиваются фиолетовый + йод, обесцвечиваются. Связано с тем, что: Это объясняется тем, что:
- имеются тейхоевые кислоты - тейхоевых кислот нет
- по строению клеточная стенка - структура клеточной стенки
представляет собой прочное мозаичная, рыхлая, поэтому
образование, поэтому после обра- после обработки этанолом поры
ботки этанолом поры клеточной остаются прежними, краска
стенки суживаются и краска не вымывается, микробы обесцве-
вымывается. чиваются
3 этап. Окраска фуксином
одни микробыдругие микробы
остаются сине-фиолетовыми, окрашиваются в красный цвет,
грамположительные: грамотрицательные:
1. Все кокки за исключением 1. Гонококки и менингококки
гонококков и менингококков
2. Все спорообразующие палочки 2. Большинство неспорообразующих
палочек
3. Из неспорообразующих бактерий 3. Спириллы
туберкулезная и дифтерийная палочки
4. Актиномицеты 4. Риккетсии
5. Грибы 5. Микоплазмы
Окраска по методу Грама не используется при изучении спирохет, простейших и вирусов.
Сущность метода окраски по Граму: отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.
Методика окраски по методу Романовского-Гимзы:
Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.
1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.
2. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.
Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.
Методика окраски по методу Циля - Нильсена:
1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин.
2. Снять бумагу, промыть мазок водой.
3. Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин до обесцвечивания.
4. Промыть водой.
5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.
6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.
Методика окраски по методу Ожешко:
1. На нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор хлороводородной кислоты и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.
2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы - синий.