Интерферометрический детектор

В основу интерферометрических детекторов положены интерференционные методы измерения показателя преломления веществ. Для жидкостной хроматографии предложено использовать интерферометр Майкельсона с объемом измерительной камеры 161 мкл и длиной оптического пути 2 мм. Работа детектора (рис. 4) заключается в следующем.

Рисунок 4. Интерферометрических детектор Майкельсона.

Луч света, излучаемый источником 1, пройдя через щель 2, разделяется в полупосеребреной стеклянной пластине 3 на два когерентных луча, один из которых направляется к неподвижному зеркалу 5, а другой — к подвижному зеркалу 7. Лучи, отраженные от зеркал, вновь соединяются при помощи пластины 3 и выходят по направлению к фоторезистору 8 через диафрагму 10 и линзу 9. На пути луча, отраженного от зеркала 7, установлена проточная кювета 6, через которую прокачивается анализируемое вещество. Для компенсации луча, отраженного от неподвижного зеркала 5, установлена компенсирующая пластина 4. Изменяя положение пластины 4, можно обеспечить одинаковую разность хода лучей, тогда на входе диафрагмы 10 будут наблюдаться интерференционные полосы. При протекании через измерительную камеру детектора 6 чистой жидкости-носителя с помощью компенсирующей стеклянной пластины и подвижного зеркала 7 добиваются такой интерференционной картины, чтобы центральная ее часть, проецируемая на фоторезистор 8, была затемнена. Изменение показателя преломления жидкости-носителя приводит к смещению интерференционной картины и ее центральной части, проецируемой на фоторезистор. В результате смещения интерференционной картины на диафрагме самописца появляется последовательность пиков, причем каждый пик соответствует прохождению перед диафрагмой 10 освещенной интерференционной полосы. Установлено, что смещение дифракционной картины пропорционально числу молей анализируемого вещества в жидкости-носителе.

Флуориметрический детектор

Принцип действия флуориметрического детектора (ФМД) основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Исследования обычно проводят в УФ-области спектра при длине волны максимального поглощения для данной группы веществ, а излучение фиксируют через фильтр, не пропускающий лучи возбуждения. Длина волны флуоресцентного излучения всегда больше длины волны поглощенного света. В связи с тем, что детектирование ведется от нулевой интенсивности, ФМД более чувствительны по сравнению с детекторами поглощения.

Рис. 5. Фильтровый ФМД: 1 — источник света; 2 — блок питания; 3 — выход на регистратор; 4 — усилитель; 5 — ФЭУ; 6 — эмиссионные фильтры; 7 — кварцевые линзы; 8 — проточноая ячейка; 9 — фильтры возбуждения.

Обычно используется прямоугольный принцип измерения флуоресценции в ФМД. Свет от источника излучения 1 (рис. 5) пропускается через фильтры 6 и фокусируется в проточной ячейке 8 с прямоугольным расположением каналов ввода и вывода света. Эмиссионное излучение проходит через фильтры 6 и измеряется с помощью фотоприемника 5. При использовании ФМД подвижная фаза (растворитель) не должна поглощать свет ни на длине волны поглощения, ни на длине волны излучения.

Для сильнофлуоресцирующих веществ чувствительность детектора достигает 10^-9 г/мл. При соответствующем выборе системы растворителей ФМД пригоден для использования в градиентной хроматографии.

С помощью ФМД с высокой чувствительностью можно детектировать аминокислоты, амины, витамины и стероиды. Высокая чувствительность является одним из главных преимуществ ФМД.

Высокая селективность и чувствительность ФМД позволяет также проводить количественный анализ микропримесей веществ и качественное определение ароматических углеводородов, биологически важных соединений, метаболитов и других флуоресцирующих соединений.

Для сильнофлуоресцирующих веществ чувствительность детектора достигает 10^-9 г/мл. При соответствующем выборе системы растворителей ФМД пригоден для использования в градиентной хроматографии.
С помощью ФМД с высокой чувствительностью можно детектировать аминокислоты, амины, витамины и стероиды. Высокая чувствительность является одним из главных преимуществ ФМД.
Высокая селективность и чувствительность ФМД позволяет также проводить количественный анализ микропримесей веществ и качественное определение ароматических углеводородов, биологически важных соединений, метаболитов и других флуоресцирующих соединений.

Техника косвенного ФМД представляет дополнительные возможности для расширения областей применения детектора. Разработаны химические методы пред- и послеколочночного получения флуоресцирующих производных большого круга органических соединений при реакциях с веществами, содержащими флуоресцирующие функциональные группы. Продемонстрирована перспективность использования послеколоночных реакций для получения флуоресцирующих производных, которые позволяют получить почти в 100 раз большие чувствительность и селективность по сравнению с соответствующими параметрами УФД, например, при определении гербицидов в образцах почвы. Результаты изучения реакций хлоранилинов с одним из флуоресцирующих аминов могут быть применены при анализе этих соединений, содержащихся в сточных водах промышленных предприятий в качестве побочных продуктов производства пестицидов и красок. Интересно использование ФМД для анализа катехоламинов и пептидов в биологических жидкостях и некоторых лекарствах, при определении флувоксамина, клавоксамина, сековерина в плазме и сыворотке крови.

Предложено применять безоконную кварцевую кристаллическую проточную ячейку для одновременного флуоресцентного, фотоакустического и фотоионизационного двухфотонного детектирования при анализе ароматических соединений. В качестве источника возбуждения использован Хе—Cl-лазер на 308 нм, сфокусированный в центре потока элюента в кварцевой ячейке. Объем ячейки 6 мкл. Рассматриваемая система сравнивалась с УФД. Ее преимуществом является возможность одновременного применения трех методов детектирования при одной конструкции. Предел детектирования на порядок ниже, чем у стандартного УФД.

Применение ФМД в ВЭЖХ дает возможность повысить селективность детектирования целого ряда соединений. Получение флуоресцирующих производных с помощью химических реакций значительно расширяет эту возможность. Флуоресцентное детектирование с одновременным изменением рН подвижной фазы после колонки позволяет увеличить флуоресценцию некоторых соединений и делает ФМД более селективным.

Селективность детектирования может быть также увеличена путем более тщательного выбора длины волны детектирования. Одновременное сканирование длин волн возбуждения и эмиссии позволяет определить чистоту пика и провести идентификацию анализируемых соединений. Применение дискретных источников возбуждения для ФМД обеспечивает более высокую интенсивность флуоресценции, большую воспроизводимость и меньший предел детектирования. Кроме Hg-лампы на 254 нм применяются Zn-лампа на 214 и 308 нм и Cd-лампа на 229 и 326 нм.

Предел детектирования для сильно флуоресцирующих веществ доведен до 5*10^-10 г.

В заключение следует еще раз отметить, что ФМД в настоящее время является одним из самых чувствительных детекторов в ЖХ. Кроме того, он отличается достаточно высокой линейностью и регулируемой селективностью. Поэтому не вызывает сомнений целесообразность дальнейшего расширения работ в этой области, перспективность которых очевидна.

Электрохимические детекторы

В ВЭЖХ наряду с широким применением оптических детекторов за последние годы наметился значительный прогресс в развитии электрохимического метода детектирования. Доказательством этого является увеличение числа публикаций по разработке и применению электрохимического детектора (ЭХД) и главным образом увеличение выпуска аппаратуры, пригодной для практического использования.

Благодаря высокой чувствительности и селективности ЭХД особенно эффективен при анализе некоторых важных для биохимии и медицины соединений, таких как эстрогены и катехоламины, присутствующие в малых концентрациях в тканях, крови и других сложных объектах исследования. ЭХД с успехом используется также для анализа веществ при исследовании загрязнений окружающей среды ввиду его высокой чувствительности и селективности к фенолам, бензидинам, нитросоелинениям, ароматическим аминам и пестицидам.

Наибольшее применение ЭХД нашел в обращенно-фазовой и ионообменной ВЭЖХ, в которой применяют полярные элюенты, содержащие растворенные ионы и обладающие достаточно высокой электрической проводимостью. В нормально-фазовой ВЭЖХ также можно использовать ЭХД, если после разделительной колонки в неполярную подвижную фазу добавлять электролит или под ходящий растворитель с высокой диэлектрической постоянной.

ЭХД основаны на определении электрохимических свойств соединений в потоке элюента, главным образом реакционной способности к окислению или восстановлению на электроде.

Рассмотрим конструктивные особенности и основные характеристики некоторых типов ЭХД.

Вольтамперометрический детектор

Наиболее распространенными в ЖХ из всех ЭХД являются вольтамперометрические детекторы (ВАД). Они применяются для анализа широкого круга неорганических и органических веществ. Работа ВАД основана на получении зависимости между силой тока, протекающего через ячейку, напряжением, приложенным к электродам, и концентрацией восстанавливающегося (или окисляющегося) на измеритель ном (рабочем) электроде вещества.

Большинство неорганических ионов могут быть электрохимически окислены или восстановлены. Среди органических соединений электроактивными являются соединения с кратными связями, окисляемыми или восстанавливаемыми функциональными группами, ароматические и другие соединения.

Поскольку для каждого класса электроактивных соединений характерен определенный потенциал окисления или восстановления, этот потенциал и определяет селективность детектора. На практике метод окисления осуществить проще, так как из элюента и из пробы не надо удалять растворенный кислород. В детекторе имеются по крайней мере два электрода: рабочий и сравнительный, по отношению к которому устанавливается потенциал рабочего электрода. В качестве сравнительного чаще всего используется каломельный или Ag/AgCl-электроды. В некоторых детекторах дополнительно устанавливается вспомогательный электрод, необходимый для подавления влияния омического падения напряжения в растворах низкой проводимости.

Вольтамперометрическими в ЖХ являются такие детекторы, в которых измеряется ток как функция времени при постоянном' потенциале на неподвижном электроде, окруженном движущейся жидкостью (элюентом). Иногда такие детекторы ошибочно называют полярографическими, хотя общепринято полярографическими детекторами считать только детекторы с капельным ртутным электродом. При превращении органического вещества А в его окисленное соединение 0 выделяется один или более электронов е^- на одну реагирующую молекулу. Начальные продукты электродных реакций очень нестабильны и необратимо реагируют с образова нием стабильных соединений Р, которые больше не реагируют на поверхности электрода и удаляются потоком элюента из ячейки детектора. На электрод должен быть подан потенциал, достаточный для первичного превращения А в О. Установившийся ток прямо пропорционален числу n электронов, константе Фарадея F и числу молей вещества, реагирующих в единицу времени (dN/dt):

I = n*F*dN/dt.

При интегрировании хроматографической зоны максимальный ток зависит от числа молей N соединения, фактически вступившего в реакцию на поверхности электрода:

Q= nFN.

Таким образом, эффективность ячейки детектора определяется соотношением числа молей N, вступивших в реакцию, к общему числу молей Nобщ, выходящих из хроматографическон колонки:

Э = (N/Nобщ)/100%.

Эффективность сложным образом зависит от конструкции ячейки и расхода потока подвижной фазы.

Рис.6 Конструкция тонкослойной ячейки ВАД.

1,3-корпус ячейки из двух пластин; 2-прокладка; 4-рабочий электрод; 5-стягивающие пластины; 6,7-выход и вход элюента.

Теоретически показано, что может быть сконструирована ячейка, обладающая 100%-ной эффективностью, однако такая ячейка непригодна для проточного ЭХД. В большинстве случаев на практике эффективность ЭХД составляет 10% и меньше. Конструкция тонкослойной ячейки ВАД представлена на рис. 3. Блок ячейки «сэндвичевого» типа из пластмассы, обычно фторопласта-3, спрессован с прокладкой из фторопласта-4 толщиной около 50 мкм, которая образует прямоугольный канал. Рабочий электрод встав лен в стенку блока. Некоторое увеличение эффективности может быть достигнуто путем увеличения площади рабочего электрода или использования двух электродов, расположенных по обе стороны от входа потока элюента.

Материал электрода влияет на характеристики ЭХД. Органические соединения окисляются или восстанавливаются с разными скоростями на поверхности различных электродов. Желательно, чтобы электродные реакции протекали с максимально возможной скоростью, чтобы ток ячейки определялся только массопередачей молекул к поверхности, а не реакцией на поверхности. Таким образом, материал электрода необходимо выбирать с учетом его собственного окисления или восстановления и возможной электрохимической реакции компонентов, составляющих подвижную фазу (вода, органические растворители, соли, примеси). Эти электронные реакции обусловливают основную часть фонового тока. Для любых электродов и во всех подвижных фазах фоновый ток увеличивается экспоненциально в зависимости от приложенного потенциала. Поэтому при высоких отрицательных и положительных потенциалах эксплуатация детектора затруднена. Детектор работает с большой чувствительностью, селективностью и воспроизводимостью при детектировании легко окисляющихся или восстанавливаемых соединений.

В качестве материалов для электродов ячеек ЭХД применяются стеклоуглерод, углеродная паста, ртуть и амальгамированное серебро или платина. Углеродная паста (смесь спектроскопичес кого графитового порошка и диэлектрического материала, такого как минеральное масло, силиконовое масло, парафиновый смазочный материал) — наиболее широко используемый материал, имеющий свойства, необходимые для проведения органических электрохимических реакций.

Хроматография предъявляет следующие требования к материалу электродов и их поверхности: невысокие значения применяемых потенциалов; химическая и физическая совместимость с подвижной фазой; длительная стабильность.

Обычно эти три требования тесно связаны между собой. Углеродная паста имеет следующие характеристики: время жизни — обычно несколько месяцев; потенциалы — не менее +0,95 В при использовании Ag/AgCl в качестве материала для сравнительного электрода; подвижная фаза может содержать органический растворитель высокой концентрации.

В ряде случаев требуется достаточно частое обновление поверхности электродов. В классической вольтамперометрии (включая полярографию) считается, что такие молекулы пробы, как липиды или белки, «отравляют» поверхность электродов после нескольких вводов пробы. Присутствие высокомолекулярных соединений в потоке приводит к серьезным проблемам, так как такие вольтамперометрические измерения проводятся для проб с концентрациями более 10^-5...10^-3 моль/л. В этом случае электродная реакция может привести к образованию полимера, который «пассивирует» поверхность и приводит к невоспроизводимым результатам анализа. В случае хроматографического амперометрического детектирования колонка очищает ПФ, поток ПФ непрерывно очищает поверхность электрода, концентрации пробы находятся в диапазоне 10^-8... 10^-6 моль/л. Кроме того, электрод подвержен единичному воздействию некоторого вещества в течение короткого временя, соответствующего ширине зоны этого вещества в ЖХ. Все указанные факторы облегчают работу электрода при хроматографическом амперометрическом детектировании по сравнению с прямыми (нехроматографическими) электрохимическими измерениями.

Потенциометрический детектор

Метод потенциометрического детектирования (ПЦД) концентрации ионов в потоке основан на измерении разности электрических потенциалов двух электрдов, один из которых в процессе измерения имеет постоянный потенциал. Так как абсолютную величину электродного потенциала измерить невозможно, измеряют потенциал измерительного (индикаторного) электрода относительно потенциала сравнитель ного электрода, который должен быть постоянным.

В потенциометрическом детекторе (ПЦД) в качестве сравни тельного обычно используется хлорсеребряный электрод. Наиболее часто потенциометрический метод измерения применяют в рН-метрии. Для точных измерений с ионселективными электродами подвижная фаза должна иметь относительно высокую и постоянную ионную силу. Следовательно, ПЦД имеет ограниченное применение для неорганических систем без градиентного элюирования. Основное преимущество ПЦД заключается в следующем: при потенциометрических измерениях не надо удалять из элюента и анализируемой пробы растворенный кислород, как, например, при полярографических измерениях.

Разработан дифференциальный ПЦД, состоящий из двух камер, разделенных ионообменной мембраной. Элюент с анализируемым веществом проходит через одну камеру, а чистый элюент — через другую. Записываются потенциалы мембраны с использованием двух сравнительных электродов. Предел детектирования 1 нмоль.

Полярографический детектор

В 1958 г. для ВЭЖХ был предложен полярографический детектор (ПГД) с ртутным капельным электродом. Однако его использование до настоящего времени ограничено. При работе с ПГД измеряется сила электрического тока между поляризуемым и неполяризуемым электродом при заданной постоянной разности потенциалов. В режиме восстанов ления из элюента и из пробы необходимо удалить растворенный кислород и примеси металлов. В последующие годы появились улучшенные конструкции ПГД. ПГД находят применение для определения нитроанилинов нитрофенолов, хлорнитробензолов, нитроалканов, нитронафталинов, n-метоксиазобензолов, N-нитрозоаминов, стероидов.

Кулонометрический детектор

Эти детекторы названы так в связи с тем, что анализируемые вещества в них электризуются полностью в отличие от амперметрических, в которых эффектив ность электролиза не превышает 10%. Кулонометрические детек торы (КМД) имеют рабочие электроды с большой поверхностью.

КМД используется для селективного определения витаминов, наркотиков и лекарственных препаратов. Для детектирования соединений с высокими окислительно-восстановительными потен циалами применен принцип двух последовательно расположенных Рабочих электродов, один из которых (вышестоящий по ходу потока является кулонометрической ячейкой для полного окисления примесных веществ с более низкими потенциалами, чем анализи руемые соединения. Детектирование последних осуществляется вольтамперометрической ячейкой. Система ВАД— КМД позволяет провести селективное детектирование неразделенных пиков.

Преимуществами ЭХД любых типов являются простота конструкций и низкая стоимость, с одной стороны, и высокая чувствительность и селективность — с другой. Причем имеется возможность регулирования селективности путем смены режимов работы детекторов, замены или модифицирования электродов.

Для ЭХД можно реализовать малый рабочий объем (до 1 нг и меньше) по сравнению с другими ВЭЖХ детекторами. ЭХД малым рабочим объемом может быть применен в микроколоночной и капиллярной хроматографии, что особенно актуально в связи с их быстрым развитием. Преимуществом ЭХД является также малая зависимость их показаний от температуры.

К недостаткам ЭХД следует отнести уменьшение их чувствительности со временем в связи с изменением характеристик электродов, применение ртути в некоторых типах ЭХД, зависимость сигнала от расхода элюента и ограниченное применение в ВЭЖХ при градиентном элюировании.

Детектор радиоактивности

Разделение и количественное определение радиоактивных веществ находит достаточно широкое применение при анализе меченых соединений в целях дозиметрического контроля при изучении химических реакций в органической и неорганической химии, биологии, микробиологии и медицине при биомедицинских исследованиях.

Известны два принципиально различных типа детекторов радиоактивности (РАД) для ЖХ.

РАД первого типа основан на методе предварительного смешивания раствора сцинтиллятора с элюентом перед входом в детектор с последующим пропусканием смеси через сцинтилляционный счетчик. Такой метод обычно называют методом жидких сцинтилляторов.

Второй тип РАД основан на использовании проточных ячеек сцинтилляционных счетчиков, заполненных частицами твердых сцинтилляторов. Например, для обнаружения ß-излучения в потоке элюента применялись твердые сцинтилляторы в виде стеклянных шариков, содержащих 2,5...7,7% лития, с общей массой около 0,5 г. Обычно проточные ячейки для РАД изготавливают из стекла или фторопласта.

Наибольшую трудность при применении РАД представляет собой обеспечение необходимой скорости счета, которая прямо пропорциональна рабочему объему детектора и обратно пропорциональна расходу потока элюента. РАД измеряет активность потока элюента в проточной ячейке и преобразует ее в напряжение выходного сигнала. При этом необходимо также учитывать фоновый сигнал, причем скорость фонового счета обычно составляет около 30 счетных единиц в минуту. При увеличении рабочего объема V детектора и уменьшении расхода потока W элюента чувствительность РАД при прочих равных условиях увеличивается. Однако эти изменения приводят к ухудшению достигнутого на колонке разрешения. С уменьшением V при постоянном W и при сохранении эффективности разделения падает чувствительность детектора. Пропорциональное изменение V и W в сторону их уменьшения или увеличения не изменяет чувствительности детектора, что означает одинаковую чувствительность и универсальность применения его как в аналитической, так и в препаративной хроматографии. Рекомендуется, чтобы объемячейки РАД был не более 0,1 объема элюента, в котором выходит первый пик хроматограммы анализируемой смеси. При применении твердых сцинтилляторов получены следующие значения эффективности счета: 6% для ³Н; 10% для ³²I; 70% для ¹⁵С и 7% для ¹²³I. В этом случае эффективность счета зависит также и от размера частиц сцинтиллятора. Уровень шума соответствует наличию ЭН в пробе в количестве (2...6) 10^-14 моль.

Преимуществами РАД являются хорошая воспроизводимость показаний, большой диапазон линейности детектирования, нечув ствительность к изменениям потока элюента и в связи с этим применимость при градиентном элюировании, низкий предел детек тирования (около 100 счетных единиц в минуту для 14 c), применимость в препаративной хроматографии и для большого круга b а- и у-радтоактивных элементов.

Детектор по светорассеиванию (ELSD)

Детектор по измерению светового рассеяния (СРД), основан на различии в давлении паров обычно используемых в ЖХ растворителей и анализируемых веществ. Принципиальная схема детектора приведена на рис. 7.

Рис. 7. Детектор светового рассеяния: 1 — вход элюента; 2 — подводящая трубка; 3 - уплотнение; 4 — сопло; 5 — камера распыления; 6 — нагреватель; 7 — корпус детектора; 8 — камера испарения; 9 — трубка для выхода луча; 10 — камера светорассеяния; 11 — трубка для выхода по. тока; 12 — стеклянное окно; 13 — двойная дкафраг. иа; 14 — стеклянный стержень.

Элюент на выходе из колонки 1 распыляется в камере 5 при повышенной температуре. В камере испарения 8 растворитель испаряется, а поток частиц нелетучих анализируемых веществ рассеивает свет лазерного луча в камере светорассеяния, в которой имеется стеклянный стержень 14, расположенный перпендикулярно лучу лазера на расстоянии 2...5 мм от него. Стержень служит в качестве коллектора рассеянного света. Через стержень часть рассеянного света попадает на фотоумножитель. Показания СРД пропорциональны массовой скорости потока вещества, что особенно важно при его использовании с колонками малого диаметра. Фоновый ток СРД при включенном лазере и установленном потоке предварительно нагретого несущего газа (CO₂ или N₂) около 2*10^-10 А; шум 1*10^-11А. Вклад СРД в расширение полосы пробы 0,1...0,2 мкл. Нулевая линия стабильна даже привысоком градиенте концентраций, однако показания пропорциональны массовому потоку анализируемого вещества в степени 1,8. Предел детектирования при анализе метиловых эфиров жирных кислот и триглициридов в различных пробах около 150 нг/с. Основным требованием является условие, чтобы анализируемые вещества были жидкими или твердыми при температуре детектора.

Поиск по сайту: