Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой, внутриклеточное развитие и репродукция фага

Лекция обсуждена на

кафедральном совещании

«____» 2009 г

д.м.н. Таран Т.В.

Ставрополь, 2009

Бактериофаги (или просто фаги) – вирусы бактерий (от лат. Bacteriophaga – пожирающий бактерии).

Бактериофагия – процесс взаимодействия фагов с бактериями, часто заканчивающийся разрушением последних.

Т.о., бактерии являются хозяевами специальной группы вирусов, названных бактериофагами, или «фагами». Хотя любой фаг строго специфичен в отношении своего хозяина, вероятно, что каждый тип бактерий может быть хозяином для одного и более фагов. Фаги имеют большое значение, т.к. являются идеальными объектами для изучения взаимоотношений хозяин-паразит и вирусной репродукции. Фаги различаются по форме, типу взаимодействия с микроб­ной клеткой и специфичности.

Выделение и очистка. Если к растущей в жидкой питательной среде культуре чувствительных бактерий добавить в небольшом количестве частицы вирулентного бактериофага, то некоторые бактериальные клетки окажутся зараженными. Вначале никаких видимых изменений зараженных клеток обнаружить нельзя. Обычно этот период продолжается от 15 мин до 1 ч и более. Затем внезапно происходит лизис зараженных клеток. При лизисе зараженных клеток высвобождается большое количество новых фаговых частиц потомства. Эти фаги могут в свою очередь заражать другие клетки популяции, при этом вновь и вновь повторяется тот же самый процесс. Через определенное время практически вся популяция бактерий будет уничтожена.

Если имеется смесь зараженных клеток и свободных фаговых частиц, то их можно разделить, используя, например, дифференциальное центрифугирование. Затем с помощью описанного метода подсчета бляшек определить по отдельности число тех и других. Если нужно определить лишь число фаговых частиц, содержащихся в суспензии, то можно избирательно убить присутствующие в ней зараженные клетки. Обычно для этого суспензию клеток и фага встряхивают с хлороформом, к которому фаги устойчивы, а бактерии погибают. Можно пропустить суспензию через мембранный фильтр, который задержит на себе бактериальные клетки, а в фильтрате окажутся частицы фага.

При необходимости получения больших количеств фага заражают фагом экспоненциально растущую в жидкой среде культуру бактерий. В результате ряда циклов развития фага большинство, а иногда и все клетки культуры лизируются. Затем оставшиеся в культуре клетки и их обломки удаляют с помощью низкоскоростного центрифугирования, а получившуюся жидкость стерилизуют либо фильтрованием, либо обрабатывая ее хлороформом. В результате получается стерильный лизат, который содержит обычно от 10⁹ до 10¹² фаговых частиц, которые освобождаются из клеток при лизисе.

Для окончательной очистки бактерифагов обычно используют ультрацентрифугирование. Даже самые мелкие частицы фага осаждаются при ускорениях порядка 100 000 g (в 10⁵ раз превышающих ускорение под действием земного притяжения). Часто предварительно вирусные частицы осаждают сульфатом аммония или некоторыми другими веществами.

Морфология. Большинство фагов имеет форму головастика или спермато­зоида, некоторые фаги имеют кубическую или нитевидную фор­му. Из всех бактериофагов наиболее изучена группа фагов, которые паразитируют на клетках штаммаB Escherichia coli. Это несколько фагов, обозначенные номерами от Т1 до Т7 (здесь Т означает «тип» –типовые). Как оказалось, три из этих фагов (Т2, Т4 и Т6) оказались близкородственными и обладают рядом свойств, которые делают их особенно удобными для экспериментальной работы. В частности, ДНК этих Т-четных фагов содержит вместо цитозина уникальное основание, 5-оксиметилцитозин. Определяя химическим методом его содержание, можно следить за синтезом вирусной ДНК в зараженных клетках в присутствии избытка бактериальной ДНК (содержащей обычный цитозин).

Долгие годы считали, что Т-четные фаги являются типичными представителями фагов. Однако при ЭМ-исследовании выявилось, что вирионы Т-четных фагов устроены гораздо сложнее, чем у других фагов, а механизмы их адсорбции и проникновения в клетку-хозяина в значительной степени специализированы. Тем не менее, после проникновения Т-четных фагов в клетку в ней, по-видимому, происходят такие же события, что и при заражении другими ДНК-содержащими фагами.

Размеры фагов колеблются от 20 до 200 микрон, т.е. в тех же пределах, что и размеры вирусов. Величина и форма фагов варьируют в довольно широких пределах даже у особей одного и того же вида, что говорит о морфологической изменчивости фагов.

Фаги могут существовать в двух формах:

1) внутриклеточной (это профаг, чистая ДНК);

2) внеклеточной (это вирион).

Головка соответствует плотно упакованному ядру, состоящему из нуклеиновой кислоты, окруженной белковой оболочкой – капсидом. Белковый капсид головки состоит из идентичных субъединиц (капсомеров), объединенных в призматическую структуру, обычно имеющую гексагональную форму в поперечном разрезе.

Бактериофаги содержат или ДНК, или РНК. Нуклеиновые кислоты фагов могут быть двунитевыми, однонитевыми, линейными, кольцевыми. Большинство фагов содержит двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо. Количество ДНК и белка примерно одинаково. Самый мелкий из известных фагов имеет головку размером 25 нм; другие фаги имеют размеры от 55×40 до 100×70 нм. У некоторых фагов внутри головки находится внутренний гистоноподобный белок, обеспечивающий суперспирализацию ДНК.

Хвостовой отросток фаговой частицы по сложности своей структуры варьирует у разных фагов. Наиболее сложного состава хвост у фага Т2, а также у ряда других коли- и тифозных фагов. У этих фагов хвост состоит, по крайней мере, из 3 частей: полого центра шириной 6-10 нм, сократительной стенки шириной 15-25 нм и терминальной базальной пластинки гексагональной формы, к которой могут прикрепляться выступы (зубцы) и (или) хвостовые нити. От последних зависит специфическая адсорбция на клетке-хозяине.

На электронных микрофотографиях, полученных при негативном контрастировании, можно видеть фаговые частицы в двух состояниях: у одних частиц головка резко выделяется на электроноплотном фоне и чехол отростка растянут, у других головка мало отличается от фона по плотности и чехол находится в сокращенном состоянии. Первое состояние характерно для активного фага, в головке которого заключена ДНК, второе – для фага, который инъецировал свою ДНК в бактериальную клетку.

Хвост фага является органом для адсорбции (для тех фагов, у которых он есть). Однако некоторые фаги полностью утратили хвосты: у РНК-содержащих фагов, например, капсид представляет собой простой икосаэдр. Фаги могут также различаться по морфологии терминальной структуры: одни имеют базальные пластинки, другие – «выпуклости», у третьих специфические терминальные структуры утрачиваются. Многие бактериофаги имеют более простое строение.

В зависимости от формы зрелых фаговых частиц различают ряд морфологических типов фагов:

Ø нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют «мужские» клетки, несущие F-плазмиды;

Ø фаги с аналогом отростка – это мелкие РНК-содержащие фаги и фаги с одной спиралью ДНК;

Ø фаги без отростка;

Ø фаги с коротким отростком и двунитчатой ДНК (Т3, Т7 и др.), отличаются между собой строением отростка;

Ø ДНК-содержащие фаги с несокращающимся «чехлом» отростка и головкой разной формы и величины (Т1, Т5 и др.). Длинный отросток заканчивается базальной пластинкой разнообразной формы;

Ø

Нитевидные фаги весьма различаются своей морфологией. Характер упаковки их вириона еще недостаточно изучен. ДНК образует комплекс с белком и служит материалом для центральной части вирусной частицы.

Большинство фагов содержит двухцепочечную ДНК, но были обнаружены фаги с одноцепочечной ДНК и несколько с одноцепочечной РНК. РНК-содержащие фаги fr, Qb и др. обладают наименьшими из известных геномов: в них 3500-4500 нуклеотидов.

Подобно другим вирусам, фаги неподвижны.

Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой, внутриклеточное развитие и репродукция фага

Наиболее часто процесс взаимодействия фага с клеткой протекает по типу продуктивной инфекции и обычно заканчивается лизисом клеток бактериальной культуры. Но возможна и абортивная инфекция, при которой фаговое потомство не образуется, а бактериальные клетки сохраняют свою жизнедеятельность. Наконец, нередко наблюдается лизогенизация бактериальных клеток инфицирующим фагом, в результате чего возникает состояние лизогении (вирогении), характеризующееся интеграцией генома фага в геном бактериальной клетки.

В зависимости от типа взаимодействия различают вирулент­ные и умеренные бактериофаги. Вирулентные бактериофаги взаимодействуют с бактерией по продуктивному типу. Умеренные бактериофаги заражают бактерий-хозяев, но не размножаются в них автономно и не вызывают лизиса - интегративный тип взаимодействия. При интегративном типе – геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней.

II стадия – пенетрация (проникновение). Фаги, имеющие сократительный механизм в хвостовой части, такие, как Т3, подобно шприцу инъецируют свою ДНК в периплазматическое пространство между клеточной стенкой и клеточной мембраной. Затем ДНК проникает в клетку через мембрану с затратой энергии хозяина.

Некоторые мелкие кубические фаги, способные адсорбироваться на половых пилях, вводят свою нуклеиновую кислоту через канал этих пилей.

Известен механизм пенетрации и других фагов. Нитевидные ДНК-содержащие фаги проникают в клетку по другому механизму. В этом случае через клеточную стенку проникает весь вирион. Белок, преобладающий в оболочке фаговой частицы, остается на клеточной мембране (ЦПМ), а фаговая ДНК, вместе с минорным оболочечным белком (А-белком) проникает в цитоплазму.

Установление фагового генома:

Однонитевая ДНК – к репликативному аппарату для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; далее – аналогично двунитевой

Двунитевая ДНК – к транскрипционному аппарату для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифических белков (ферментов и структурных)

РНК-геном – к трансляционному аппарату для синтеза вирусспецифических белков (ферментов репликации и структурных).

III стадия – биосинтез фаговой НК и белков капсида. В первые минуты после проникновения НК внутрь бактериальной клетки в течение латентного периода фаговые частицы обнаружить не удается. У E. coli этот период продолжается в среднем 25 мин, в искусственно разрушенных бактериальных клетках также не удается обнаружить фага.

Инъецированная ДНК фага, прежде всего, вызывает полную пере­стройку метаболизма зараженной клетки. Сразу же прекращается синтез бак­териальной ДНК, через несколько минут прекращается также синтез бакте­риальной РНК и бактериальных белков, хотя общее количество белка про­должает непрерывно возрастать. Синтез ДНК возобновляется, даже с повы­шенной скоростью.

Сначала фаговая ДНК образуется за счет распавшейся бактериальной. Эту перестройку и последующее новообразование фаговой ДНК можно проследить по увеличению количества 5-гидроксиметилцито­зина – основания, специфичного для ДНК Т-четных фагов.

Необходимые для синтеза фаговой ДНК ферменты образуются в клетке уже вскоре после заражения; это так называемые «ранние» белки. К «поздним» белкам относятся белки оболочки и фаговые лизоцимы, или эндолизины; они образуются лишь во второй половине латентного периода.

Репликация фаговой ДНК протекает в соответствии с общим механизмом репликации, однако детали этого механизма варьируют в зависимости от того, реплицируется ли фаговая ДНК в виде кольцевой (симметричный и асимметричный способы) или в виде линейной молекулы. В течение очень короткого периода (минуты) в клетке синтезируется несколько сотен новых фаговых хромосом, которые по мере образования беспорядочно обмениваются генетическим материалом.

Поиск по сайту: