РНК-полимеразы: общие сведения

ТРАНСКРИПЦИЯ - ОБЩЕБИОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ

Транскрипция: введение

Транскрипция является первой стадией реализации (считывания) генетической информации, на которой нуклеотидная последовательность ДНК копируется в виде нуклеотидной последовательности РНК. В основе механизма копирования при транскрипции лежит тот же структурный принцип комплементарного спаривания оснований, что и при репликации. Рибонуклеозиды (цитидин, гуанозин, уридин, аденозин), синтезированные в процессе клеточного метаболизма в форме рибонуклеозидтрифосфатов (rNTP) CTP, GTP, UTP, ATP, пристраиваются к комплементарным основаниям ДНК, а именно C к G, G к C, U к A, A к T. Транскрипция идет от начала транскрипционной единицы до ее конца. Транскрипция осуществляется ферментами РНК-полимеразами асинтезирующими РНК на ДНК-матрице из рибонуклеозидтрифосфатов с участием многочисленных факторов транскрипции - регуляторных белков, осуществляющих высокоспецифические белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия. .

Транскрипция у эукариот происходит в клеточном ядре, а последующая трансляция - в цитоплазме на рибосомах. РНК-транскрипт в форме рибонуклеопротеиновых частиц попадает в цитоплазму и претерпевает ряд изменений, которые называют посттранскрипционными процессами .

Транскриптон

Синтез молекул РНК начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами , и завершается в терминаторах. Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции ( Lewin B., 1980 ) - транскриптон. В пределах каждого транскриптона копируется только одна из двух нитей ДНК, которая называется значащей или матричной. Во всех транскриптонах, считываемых в одном направлении, значащей является одна нить ДНК; в транскриптонах, считываемых в противоположном направлении, значащей является другая нить ДНК. Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друга нетранскрибируемыми участками ДНК, а могут и перекрываться, в частности так, что в пределах участка перекрывания матричными оказываются обе нити. Разбиение ДНК на множество транскриптонов обеспечивает возможность независимого считывания разных генов, их индивидуального включения и выключения. У эукариот в состав транскриптона, как правило, входит только один ген.Термины "транскрипционная единица" или "транскриптон" по смыслу близки термину "ген", но они не всегда совпадают. Так, транскрипционные единицы прокариот, как правило, заключают в себе генетическую информацию нескольких генов и называются оперонами . Продуктами транскрипции оперонов являются полицистронные мРНК , в результате трансляции которых рибосомами образуется несколько белков. Белки, кодируемые полицистронными мРНК, обычно функционально связаны друг с другом и обеспечивают протекание какого-либо метаболического процесса, например, биосинтеза определенной аминокислоты или утилизацию углеводов в качестве источника углерода. Организация генов в виде оперонов облегчает координированную регуляцию их экспрессии на уровне транскрипции. Согласованная регуляция транскрипции (и других этапов экспрессии) многих генов, не образующих одного оперона, чаще всего осуществляется специфическими белками-регуляторами, которые взаимодействуют с гомологичными регуляторными нуклеотидными последовательностями, маркирующими гены данной группы.

Транскрипт первичный

Первичный РНК-транскрипт, или про-мРНК, синтезированный на транскрипционной единице , в большинстве случаев длиннее, чем последовательность нуклеотидов, соответствующая конечному продукту (полипептиду, тРНК, рРНК). У эукариот первичный транскрипт (молекулярная масса от 10⁶ до 1.5*10⁷) может быть в 10 раз длиннее, чем мРНК, поступающая для трансляции. Первичный РНК-транскрипт претерпевает изменения в совокупности называемые процессингом . При процессинге к нему сначала присоединяются колпачок и poly(A) , а затем в результате многократного сплайсинга он укорачивается, и одновременно происходит внутреннее метилирование с образованием 6-метиладенозина.

Про-мРНК и мРНК всегда соединены ионными связями с белками и образуют рибонуклеопротеиновые частицы .

Матричная РНК (мРНК)

Зрелая мРНК эукариот наряду с основной последовательностью нуклеотидов, в которой закодирована информация о последовательности аминокислот в соответствующем белке, содержит целый ряд некодирующих последовательностей, присутствие которых необходимо для ее трансляции рибосомами. Одни из этих последовательностей, такие как кэп-группа и 3'-концевая поли(А), не кодируются непосредственно генами, а добавляются ко- и посттранскрипционно, другие имеют генное происхождение. Эти последовательности часто содержат регуляторные сигналы, обеспечивающие определенный уровень трансляции мРНК рибосомами.

Участок мРНК, расположенный между кэп-группой и первым инициирующим кодоном основной открытой рамки считывания (ОРС) , которая и несет информацию о последовательности аминокислот в белке, получил название 5'-концевой нетранслируемой области (5'UTR - 5' untranslated region), или лидерной последовательности . Сегмент мРНК, расположенный между последним терминирующим кодоном основной ОРС и началом поли(А)- последовательности , называют 3'-концевой нетранслируемой областью (3'UTR) . Первое название не совсем удачно. Последовательности 5'UTR, как правило, способны образовывать сложные вторичные структуры типа "стебель-петля" и содержать короткие ОРС (uORF - upstream open reading frame) , которые оказывают сильное влияние на эффективность трансляции мРНК.

Помимо этого, 5'UTR могут включать в себя регуляторные последовательности, распознаваемые транс-действующими белковыми факторами. Последовательности 5'UTR обеспечивают регулируемую трансляцию мРНК (и координированную экспрессию соответствующих генов) в онтогенезе многоклеточных организмов.

3'UTR и поли(А)-последовательность оказывают влияние на состояние рибосом после терминации синтеза полипептидных цепей. Кроме того, 3'-концевая поли(А)-последовательность участвует в инициации трансляции.

МРНК: Лидер

Лидерной называется 5'-нетранслируемая часть мРНК . Обычно лидерная последовательность имеет в длину несколько десятков нуклеотидов, но бывают лидеры длиной в несколько сот нуклеотидов. Концевая последовательность, как правило, длиннее, от нескольких сот до тысячи и более нуклеотидов. 5'-конец мРНК, несущий кэп , необходим для начала трансляции. Есть данные, что мРНК, где лидерная последовательность между кэпом и инициирующим кодоном в начале кодирующей зоны очень велика, транслируется плохо. Удаление значительной части лидера ведет к тому, что уровень трансляции существенно возрастает.

МРНК: трейлер

Трейлером называется 3'-нетранслируемый конец мРНК . Он, вероятно, тоже может выполнять функциональную нагрузку. Есть данные ( Caput ea, 1986 ; Shaw ea, 1986 ), что некоторые последовательности в ее составе, богатые T(U), резко дестабилизируют мРНК, так что время жизни такой мРНК в цитоплазме оказывается очень небольшим. Удаление соответствующей области из гена резко удлиняет время жизни мРНК .

МРНК: колпачок

Колпачок представляет собой весьма необычную последовательность: 7-метилгуанозин связан 5'-концом через три фосфата с 5'-концом следующего нуклеозида. Кроме того, оба следующих нуклеозида метилированы.

МРНК: poly(A)

poly(A) - это монотонная последовательность примерно из 200 остатков аденозина. Она отсутствует у гистоновых мРНК. Наличие poly(A) на 3'-конце мРНК , видимо стабилизирует мРНК . Лишенные poly(A) РНК, хотя и транслируются, но время их жизни сокращается.

РНК-полимеразы: общие сведения

У эукариот существуют три типа РНК-полимераз, каждый из которых ответственен за транскрипцию различных групп генов. Эти ферменты, называемые РНК-полимераза I , РНК-полимераза II и РНК-полимераза III , ( Chambon P., 1975 ; Brown D., 1981 ; McKnight ea, 1982 ) структурно сходны друг с другом и имеют некоторые общие субъединицы, тогда как другие субъединицы являются уникальными. Каждая из этих РНК-полимераз, полагают, содержит 10 или более полипептидных цепей. РНК-полимеразы эукариот и бактерий эволюционно родственны.

Только одна из них, а именно, РНК-полимераза II , транскрибирует гены, которые затем будут транслированы в белки. Большинство малых РНК, которые образуют snRNP , синтезируются с помощью РНК-полимеразы II.

Две другие полимеразы катализируют образование различных типов РНК, которые составляют часть белок-синтезирующего аппарата: РНК-полимераза I синтезирует высокомолекулярную рибосомную РНК , а РНК-полимераза III - разнообразные низкомолекулярные стабильные РНК, в том числе тРНК и рибосомную 5S-РНК . Все три фермента имеют молекулярную массу, приблизительно равную 500000.

РНК-полимеразы I, II и III отличаются по чувствительности к токсину альфа-аманитину : РНК-полимераза I не чувствительна к нему; РНК-полимераза II очень чувствительна; РНК-полимераза III умеренно чувствительна. РНК- полимераза II транскрибирует гены, РНК-продукты которых будут транслированы в белки . Другие две РНК-полимеразы синтезируют РНК, которые выполняют структурные или каталитические роли, в основном, как часть белок-синтезирующего аппарата.

Хотя синтезированные РНК-полимеразой II транскрипты составляют более половины РНК, синтезированной в результате транскрипции ДНК, большая часть РНК таких транскриптов нестабильна и, соответственно, короткоживуща. Следовательно, производные от нее гетерогенные ядерные РНК hnRNA в клеточном ядре и цитоплазматическая мРНК составляют лишь минорную фракцию тотальной клеточной РНК (табл.)

В соответствии с субъединичным составом РНК-полимеразы подразделяются на две группы.

К первой группе относятся ферменты, состоящие только из одной субъединицы, среди них - РНК-полимеразы митохондрий и бактериофагов , например, SP6 и T7 . Эти РНК-полимеразы транскрибируют небольшое число генов простых геномов, и для их функционирования не требуется сложных регуляторных воздействий.

Вторую группу составляют сложно устроенные РНК-полимеразы бактерий и эукариот , которые представляют собой многосубъединичные белковые комплексы, транскрибирующие сотни и тысячи различных генов. Такие ферменты во время своего функционирования реагируют на многочисленные регуляторные сигналы, поступающие от регуляторных последовательностей нуклеотидов и белковых факторов.

Разделение РНК-полимераз по структурно-функциональному признаку является упрощением. Имеются данные, что просто устроенные фаговые РНК-полимеразы функционируют in vivo в комплексе с другими белками бактериальных клеток, которые могут существенно изменять их ферментативные свойства.

РНК-полимераза E.coli

Наиболее изученной из бактериальных ферментов является РНК- полимераза E.coli. Она осуществляет транскрипцию всех бактериальных генов.

Фермент состоит из пяти субъединиц: бета'- (молекулярная масса 165 кДа), бета- (155 кДа), двух альфа- (35 кДа каждая) и сигма- (чаще всего 70 кДа (сигма70)). Комплекс из четырех субъединиц бета-бета'-альфа-альфа, часто обозначаемый буквой Е (enzyme), образует так называемый минимальный (кор-) фермент E.coli , который способен осуществлять все основные этапы транскрипции, за исключением правильной инициации. Для инициации транскрипции требуется присутствие определенной регуляторной сигма-субъединицы, необходимой для распознавания РНК-полимеразой промоторов бактериальных генов, определяющей специфичность взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами и, возможно, последующую изомеризацию комплекса РНК-полимераза-промотор, необходимую для начала синтеза РНК. Полный фермент, включающий сигма70-субъединицу, часто называют холоферментом и обозначают Есигма70. РНК-полимераза Есигма70 способна транскрибировать большинство (но не все) генов E.coli. В частности, для транскрипции генов теплового шока , оперонов gln или nif требуется включение в состав полного фермента другой регуляторной субъединицы - сигма54 (молекулярная масса 54 кДа) вместо сигма70 с образованием фермента Eсигма54 .

Описано до десяти различных сигма-факторов, объединение которых с минимальным ферментом дает возможность образующимся холоферментам узнавать разные промоторы. Все четыре субъединицы кор-фермента обеспечивают контакт РНК-полимеразы с промоторами. При этом бета'-субъединица участвует в связывании фермента с ДНК, бета-субъединица образует каталитический активный центр, а альфа- субъединицы обеспечивают правильное взаимодействие фермента с промоторами.

Данные такого рода получают с использованием ферментов, у которых под действием мутаций изменены конкретные субъединицы, и если, например, мутация в гене альфа-субъединицы нарушает связывание РНК-полимеразы с ДНК, делаются соответствующие выводы. Однако любая мутантная субъединица в составе олигомерного фермента может изменять его конформацию и придавать ферменту самые неожиданные свойства. Более прямым методом определения мест контакта макромолекул при белок-белковых и белково-нуклеиновых взаимодействиях является метод поперечных сшивок с использованием бифункциональных химических агентов. Такие химические соединения образуют ковалентные связи (поперечные сшивки) между близкорасположенными реакционноспособными группами.

Наличие контакта между макромолекулами нельзя однозначно интерпретировать в пользу его функциональной значимости.

Поиск по сайту: