Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Разработка ускоренного метода измерения лактозы в молоке с помощью биосенсора глюкозы крови

Аннотация

Существующие методы измерения лактозы в молочной продукции утомительны, занимают много времени и могут потребовать дорогостоящего оборудования и квалифицированных специалистов. Цель этого исследования заключалась в разработке нового и быстрого метода для обычного измерения лактозы в молочной продукции. Предложенный метод основан на быстром гидролизе лактозы с помощью β-галактозидаза и впоследствии измерения с помощью глюкометра. Глюкометры были разработаны после десятилетий научно-исследовательских и клинических испытаний и широко используются во всем мире людьми с диабетом для мониторинга их уровня глюкозы в крови. Метод был разработан и проверен серией экспериментов. В первом эксперименте были определены температура и время, необходимые для почти полного гидролиза лактозы. Впоследствии были оценены влияние глюкометров и их тест-полосок. Мы обнаружили, что показания не отличаются существенно. Однако тест-полоски значительно отличаются друг от друга. Во втором эксперименте предложенный метод прошел проверку с использованием различных концентраций растворов лактозы (1.9-6,5%) и сравнен с методом ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). В третьем эксперименте предложенный метод использовался для определения содержания лактозы в сыром молоке. Предложенный метод показывает возможность быстрого, обычного и недорого измерения лактозы в молоке и других молочных продуктах.

 

Введение

Лактоза является основным углеводом в молоке большинства млекопитающих. Содержание лактозы в коровьем молоке, как правило, между 4,4 и 5,2%. Лактоза также имеет большое значение благодаря ее экономической ценности и вкладу в сенсорные и функциональные свойства молочных продуктов. Быстрое и точное определение лактозы имеет решающее значение в процессе контроля брожения сыворотки сыра, а также мембранного отделения лактозы из сыворотки сыра. Следовательно, возможность быстрого и недорогого метода определения лактозы имеет будущее в молочной индустрии.

Доступны несколько методов для определения содержания лактозы молока и молочных продуктов, в том числе ВЭЖХ, ферментативный метод, поляриметрии и гравиметрический метод. Ферментативный метод имеет некоторые преимущества над остальными с точки зрения доступности реагентов в виде комплекта и оптимизированной процедурой для молока и других молочных продуктов. В совместном исследовании, проведенном Клейном и Траутом (1984), ферментативный метод сравнивался с гравиметрическим совместно с «АОАС» (Ассоциация аналитических сообществ). Они обнаружили, что содержание лактозы, определенное с помощью ферментативного метода на 0, 49% меньше чем в гравиметрическом методе. В отличие от этого Эссиг и Клейн (1983) сравнили ферментат. метод с методом снижения (восстан-я) меди и нашли соответствие между ними. Линч и соавторы (2007) рекомендуют корректировать длину пути и систему мер веса для фермент. метода и тем самым значительно улучшить производительность метода. Относит. отклонение воспроизводимости (RSDr и RSD R) для усовершенствованного метода было рассчитано по результатам 11 лабораторий и 8 пар повторов оказались 0, 29 и 0, 57% соответственно. В дополнение к этим методам «разница лактозы» является популярным упрощенным методом для косвенной оценки лактозы в таких молочных продуктах как молоко, сыр и сыворотка. Однако, погрешности измерений при определении общего содержания сухих веществ, белков, жиров и минералов объединены и происходят в результате высокой степени неопределенности в оценке лактозы. Кроме того, такие соединения как органические кислоты и другие засчитываются как лактоза. Некоторые исследователи предлагают различные биосенсоры для измерения лактозы в жидких пробах. Большинство биосенсоров базируется на амперометрическом или кондуктометрическом зондировании и требуют доп. исследований, которые должны применяться в качестве обычного метода в условиях молоч. завода.

Имеющиеся в настоящее время методы определения лактозы имеют ряд ограничений, в том числе достаточное время и необходимость в дорогостоящих приборах, а также квалифицированных специалистах. Следовательно, молочная промышленность нуждается в быстром и недорогом методе, который может быть выполнен с минимально подготовленным аналитиком. Для удовлетворения этих требований, экономически эффективный подход заключается в адаптации существующей технологии и использовании ее для определения лактозы в молоке и молочных продуктах. В связи с этим, предлагается новый метод использования имеющихся в продаже биосенсоров глюкозы в крови.

Глюкометры крови были разработаны после нескольких десятилетий интенсивных исследований и клинических испытаний. Они используются во всем мире, чтобы контролировать концентрацию глюкозы в крови. Технология глюкометров и их клинические и технологические оценки можно найти в различных публикациях. Глюкометры крови чрезвычайно удобны для пользователей и занимают совсем немного места. Первым шагом в использовании глюкометров для измерения лактозы в молочных продуктах является гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы используя б-галактозидазы. Этот шаг используется в любом методе, связанном с ферментативным определением лактозы. Реакция выглядит следующим образом: лактоза + H2O———>глюкоза + галактоза.

Количество глюкозы образуется в процессе гидролиза лактозы пропорционально количеству лактозы в образце. В дальнейшем концентрация глюкозы определяется с помощью глюкометра крови. Показания глюкометра затем используется для определения концентрации лактозы в образце. Цель настоящего исследования состояла в разработке и оценке метода определения лактозы в молоке с помощью глюкометра.
Материалы и методы.
Экспериментальный дизайн

Экспериментальный подход был проведен в 3 эксперимента. В первом эксперименте, идеальные условия для полного гидролиза лактозы и эффект глюкометра и тест-полосок много изучались. Во втором эксперименте, предложенный метод был проверен с помощью 25 образцов растворов лактозы с использованием 5 лотков тест-полосок. В последнем эксперименте новый глюкометр-метод был оценен на молоке.
Образцы растворов
Образец раствора лактозы был подготовлен ​​путем растворения моногидрата лактозы в дистиллированной воде для получения концентрации 0,38% лактозы.0,38% раствор разбавляют дистиллированной водой для создания 8 образцов растворов лактозы. Концентрация лактозы позднее была подтверждена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на основе эталонного метода. Свежее образцы растворов лактозы были подготовлены в ходе этого исследования и проанализированы в тот же день.

Глюкометр

Relion Ultima самоконтролирующиемые глюкометры крови и тест-полоски использовались для измерения концентрации лактозы в образцах растворов, а также в пробах молока. Глюкометр и тест-полоски были приобретены в местном супермаркете. Рабочий диапазон измерения сахара в крови был от 20 до 500 мл / л (0, 02 – 0, 05% массы/объем). Любое измерение, выше или ниже этого диапазона был показан на глюкометре, как "LO" или "HI" соответственно.
Теоретически, глюкометр любого производителя может быть использован для измерения концентрации лактозы в молоке и молочных продуктах. Однако наиболее важным фактором при выборе глюкометра для измерения лактозы является то, что на некоторые глюкометры и тест-полоски влияет наличие галактозы, мальтозы или ксилозы. Галактоза было нашей главной задачей, поскольку она является одним из конечных продуктов гидролиза лактозы. Глюкометры, которые реагируют на глюкозу дегидратированного пирролохинолинхинона-хинон или глюкозу принципы краситель оксидоредуктаз не относятся к глюкозе и могут дать повышенные показания счетчика глюкозы в присутствии галактозы. Тем не менее, глюкометры и тест-полоски, которые реагируют на глюкозу дегидратированного никотинамид аденин динуклеотида (GDH-NAD), глюкозо-оксидазы или гексокиназы глюкозы являются наиболее подходящими для определения лактозы в молоке. Глюкометр Relion используется в настоящей работе на основе GDH-NAD и не подергается влиянию галактозы. Sehleis предоставило список мониторинговых систем уровня глюкозы вместе с ферментом, используемым в каждой из систем.

Фермент
B-галактозидазой, обычно называется лактаза, была получена Корпорацией ферментного развития(Нью-Йорк). Фермента имел активность от 2300 до 2700 единиц дрожжей лактазы / г. Он является производным от молочных дрожжей рода Klyveromyces и имеет оптимальную активность в период между 31 и 40ºС.
Высокоэффективная жидкостная хроматография на основе эталонного метода.
Система ВЭЖХ, оборудованная растворимым модулем доставки, многоканальным детектором сканирования длины волны(190-600 нм), и 20 мл образца впрыска топлива, была использована для измерения концентрации лактозы в образцах растворов и молока. Система ВЭЖХ также включает детектор индексов преломления и модель 631 колонка нагреватель.300 - * 7,80-мм ионного исключения колонки поддерживается при температуре 65ºС был использован для выделения лактозы. Серная кислота используется в качестве подвижной фазы со скоростью от 0, 6 мл / мин. Подвижной фазы была подготовлена путем растворения серной кислоты в ВЭЖХ-уровне воды.

Пример приготовления образца раствора лактозы.

Около 0, 5 мл разбавленного молока выливают в центробежный фильтр с молекулярным весом отсечки 3 кДа. Пробирки центрифугируют в 17, 746 * г в течение 15 мин. Собранный фильтрат встряхивают и вводят в систему ВЭЖХ. Лактозы была подсчитана в пробах молока на основе внешнего стандартного метода, как описано Upreti соавт.
Эксперимент 1
В эксперименте 1, усилия были направлены на сокращение времени, необходимого для полного гидролиза лактозы, а также на изучение факторов, влияющих на показания глюкометра. Первоначально был проведен эксперимент по оптимизации условий, необходимых для полного гидролиза лактозы. Для этой цели был выбран 0, 35% раствор лактозы, который был близок к наибольшей концентрации образца раствора лактозы. Мы предположили, что оптимальные условия для полного гидролиза по 0, 35% лактозы, могут быть применены к более низкой концентрации лактозы. Серию стеклянных пробирок с 5 мл 0, 35%-ным раствора лактозы и 0, 1 мл б-галактозидазы инкубируют при 4 выбранных температурах на водяной бане. Пробирки, содержащие растворы лактозы были удалены из водяной бани через заданные промежутки времени и помещены в кипящую водяную баню на 5 мин для инактивации фермента. Особая осторожность необходима, для того чтобы предотвратить потерю влага в процессе инактивации. Гидролизованный раствор лактозы затем охлаждают до комнатной температуры и анализируют на лактозу с использованием ранее описанного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Затем был проведен эксперимент для оценки воздействия глюкометра, тест-полосок и концентрации лактозы в образце раствора на показания глюкометра. Для этой цели мы использовали расчет случайного факториала с 3 факторами. Для этого 5 мл раствор лактозы и 0, 1 мл фермента лактазы встряхивали и инкубировали при 40ºС. Через 10 мин, образец был проанализирован 2 глюкометрами с использованием 2 срий тест-полосок. В каждой партии тест-полоски, трижды измерения были записаны. Показания глюкометра были сведены в таблицу и проанализированы с помощью процедуры PROC GLM в SAS.
Эксперимент 2
Целью эксперимента 2 была для проверка предложенного метода в образцах раствора. Для проведения этого эксперимента, был использованы 1 глюкометр и 5 серий тест-полосо. Первоначально, калибровочные кривые были получены по показаниям глюкометра каждой партии тест-полосок с использованием 8 стандартных образцов растворов лактозы в диапазоне от 0, 05 до 0, 38% (0. 05, 0. 09, 0. 14, 0,19, 0 24., 0,29, 0. 33 и 0. 38%). Каждый стандартный раствор был проанализирован в двух экземплярах, чтобы записать показания глюкометра. Одновременно, стандартные образцы были проанализированы на концентрацию лактозы с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии на основе эталонного метода. Универсальная модель калибровки была разработана на основе объединения данных из всех серий тест-полосок для разработки единой модели регрессии. Кроме того, показания из каждой партии тест-полосок и соответствующие им концентрации лактозы в ВЭЖХ на основе эталонного метода были индивидуально проанализированы, чтобы разработать ряд конкретных уравнений растворов лактозы для каждой серии тест-полосок. Впоследствии, 25 новых стандартных растворов лактозы, которые варьировались в концентрации от 1,9 до 6,5% лактозы были подготовлены отдельно (путем растворения лактозы в дистиллированной воде) и измеряют концентрацию лактозы с использованием предложенного глюкометр метода. Концентрация лактозы, используя метод калибровки уравнений и калибровки уравнения из объединенных данных была определена.

Концентрации лактозы, полученные от каждой партии тест-полосок с использованием глюкометра и метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на основе эталонного метода, были сведены в таблицу и сравнены с помощью статистического метода сравнения, включая регрессионный анализ. MS Excel была использована для разработки моделей линейной регрессии. С помощью регрессионного анализа, статистические параметры, такие как тангенс (градиент), цена деления, их 95% доверительные интервалы, и стандартное отклонение остатков были извлечены. Кроме того, парный Т-тест был проведен для оценки соответствия между методом ведения и предлагаемым методом. Другие показатели, такие как средняя разница (d) и средняя разница в процентах (D) также используется для оценки производительности предлагаемых методов.
Эксперимент 3
В эксперименте 3, калибровочные уравнения были разработаны с использованием раствора обезжиренного молока и метод был проверен с использованием 10 образцов сырого молока. Были подготовлены р-ры обезжиренного молока, содержащие 3,5% белка и различные концентрации лактозы (ориентированные на 2, 3, 4, 5 и 6%) с использованием молока белкового концентрата 85, обезбелоченной сыворотки и дистиллированной воды. Калибровочные образцы были проанализированы на фактическое содержание лактозы с помощью ранее описанных ВЭЖХ на основе эталонного метода. Для глюкометр-метода, около 1 г молока обезжиренного разбавляют 20 г дистиллированной воды. Часть разбавленного образца (5 мл) смешивают с 0.1 мл б-галактозидазы и инкубируют при 40 ° C в течение 10 мин. Две серии тест-полосок (дубликат измерений в каждой партии) были использованы для оценки каждого образца, а также много конкретных и универсальных (на основе объединения данных серий полосок) калибровочных кривых было разработано.
Десять образцов сырого молока были получены от отдельных коров в Научно-исследовательском молочном и Учебный центр. Каждый образец анализировали на содержание лактозы с использованием глюкометр-метода и ВЭЖХ на основе эталонного метода. В предлагаемом способе глюкометр-метода, 1 г молока разбавляют 20 г дистиллированной воды и встряхивают. Затем 0,1 мл б-галактозидазы был добавлен в 5 мл разведенной пробы молока и выдерживан при 40 ° С на водяной бане. Через 10 мин разведенный образец молока встряхивают и анализируют в двух экземплярах с использованием глюкометра. Концентрация лактозы рассчитывается по глюкометр показаниям с использованием универсальных и специфических моделей калибровки. Показания содержания лактозы, полученные с использованием глюкометр-метода и выше описанного метода были сопоставлены.

Концентрации лактозы, полученные от каждой партии тест-полосок с использованием глюкометр метода были сравнены с ВЭЖХ на основе эталонного метода методом сравнения статистики, включая регрессионный анализ. Программа MS Excel была использована для разработки моделей линейной регрессии. Статистические параметры, такие как тангенс, цена деления, их 95% доверительные интервалы, и стандартное отклонение остатков были извлечены. Кроме того, парный Т-тест был проведен для оценки соответствия между методом ведения и предлагаемым методом. Кроме того, парный т-тест был проведен для оценки соответствия между 2 методами. Кроме того, другие показатели, такие как d и D были использованы для оценки производительности предлагаемых методов.
Результаты и обсуждение
Эксперимент 1
Гидролиз лактозы. Гидролиз лактозы с использованием B-галактозидазы был первым шагом в предлагаемом методе измерения сахара глюкометром. На рисунке 1 показано постепенное снижение лактозы во время инкубации с б-галактозидазой. Лактоза не была обнаружена в ВЭЖХ-методе после 15, 10, 8 и 6 мин инкубации при 20, 25, 30 и 40 ° C, соответственно. Следовательно, лактоза полностью гидролизировалась в течение 10 мин при температуре инкубации от 25 до 40ºС. Косински (1981) сообщил, что скорость гидролиза лактозы зависит от температуры. В оставшейся части нашего исследования, условия гидролиза были стандартизированы на уровне 2% фермента инкубации при 40 ° С в течение минимум 10 мин.
Воздействие глюкометра, тест-полосок, а также концентрации лактозы. Как показано в Таблице 1, показания глюкометра значительно (P <0,05), зависели от тест-полосок и начальная концентрация лактозы в стандртных растворах. Тем не менее, глюкометр и взаимодействие условий не были статистически значимыми (р> 0,05). Kirstensen соавт. изучал изменения во внешней оценке качества глюкометров. Авторы пришли к выводу, что разница была значительной и обнаружили столько же, сколько 1,3 ммоль / ч (2,34 мг / дл), разница в контрольных растворах. Как показано в Таблице 2, средняя абсолютная разница между сериями тест-полосок была относительно высокой (16 мл / л) на самых высоких концентраций лактозы (381 мг / дл) проанализировали. Тем не менее, для остальных концентраций лактозы (от 48 до 333 мг / дл), средняя абсолютная разница была меньше, чем сообщалось ранее значения, это, вероятно, связано с достижениями в области технологии тест-полосок, так как предыдущие исследования Kirstensen соавт.

 




Поиск по сайту:

©2015-2020 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.