Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Способи одержання генетично-модифікованих мікроорганізмів



 

Як відомо, здатність організмів синтезувати ті чи інші біомолекули, в першу чергу білки, закодовано в їх геномі. Тому достатньо «добавити» потрібний ген, взятий із іншого організму, в бактеріальну клітину, яка здатна рости в простих умовах і швидко розмножуватися. Але спроби провести перенос бактерії безпосередньо геномної ДНК призвели до суперечливим результатам. Тільки в 70-ті роки отримані результати з застосування так званої векторної трансформації. В основі цього методу – використання векторних молекул – ДНК, які мають здатність переносити гени, які вони містять в клітину, де ці молекули реплікують автономно або після інтеграції з геном. Вирішальну роль в цих експериментах відіграли також методи тримання індивідуальних генів, створення їх в необхідній кількості шляхом клонування, тобто є практично не обмежуваного розмноження в бактеріальних клітинах.

В основі всіх досягнень генетичної інженерії лежить одна із властивостей будови генома бактерій – наявність в них не великих, відрізняючись від хромосом, кільцевих молекул ДНК, які мають назву плазміди. Плазміди широко розповсюджені в природі і зустрічаються в меншій кількості прокаріотичних організмів, а також у нижчих еукаріот – дріжджі. Важливою властивістю плазмід є їх здатність реплікуватися (розмножуватися) разом з ДНК клітини – хазяїна, і тому в останній час їх вважають внутрішньоклітинними паразитами, але симбіонтами. Клітини – хазяїни не потребують в плазмідах для виживання в простих умовах, але часто плазміди надають їм ряд особливих властивостей. Плазміди надають їм здатність до статевого розмноження (F - фактор), стійкість до антибіотиків і дезінфікуючих речовин (R - фактор), можливість засвоєння деяких складних органічних речовин, наприклад, вуглеводів.

Основна маса дослідів, які призвели до розвитку генної інженерії, проводилися на класичному об’єкті мікробіологів – кишковій паличці Esherichia coli. За допомогою спеціальних ферментів – ендонуклеаз рестрикції, або рестриктаз, плазміда, яка несе який-небуть маркерний ген, наприклад, ген стійкості до певного антибіотику, розрізається в певному місці з кожної сторони декількох (від 1 до 5) неспарених основ – «липких кінців». За допомогою таких же рестриктаз отримують фрагмент геному організма донора, який несе в собі потрібний ген, наприклад, ген людського інсуліну. В останній час донорна ДНК частіше отримують шляхом «пришивання» «липких кінців» до молекули ДНК, отриманої шляхом зворотної транскрипції з матричної РНК потрібного гену (кДНК). Головну роль тут відіграє фермент зворотна транскриптаза, або ревертаза, вперше відкрита у ретро вірусах (таких як ВІЧ і деякі збудники злоякісних новоутворень – онковірусів). Алі за рахунок комплементарної взаємодії неспарених основ «липких кінців» відбувається включення потрібного гена в плазміду, при цьому утворюється нова рекомбінантна (гібридна) ДНК. Завершує процес фермент ДНК- лігаза, який ковалентно зашиває розриви в ланцюгах ДНК.

Наступний етап – перенос рекомбінатної плазміди в бактерію. Такий процес – включення чужорідної ДНК в бактеріальну клітину – має назву трансформації, а молекула ДНК – вектор. Це явище інколи зустрічається в природі, що говорить про те, що трансформація – це природній біологічний процес. В природніх умовах трансформація зустрічається у таких бактерій, як збудник пневмонії Diplococcus pneumonia і Bacillus subtilis. Необхідною умовою трансформації є синтез бактеріями особливого білка компетентності, що проходить тільки під час активного росту колоній мікроорганізмів. Бактерії з трансформованими плазмідами легко відібрати: вони здатні рости в присутності антибіотика, проти якого в плазміді наявний ген стійкості.

Другий спосіб складання векторних молекул використовує бактеріофаги – особливу групу вірусів, які заражають виключно бактерії. Найбільш широке застосування отримав бактеріофаг λ. Середня частина геному цього вірусу не несе в собі важливих функцій і може бути замінена на чужорідний фрагмент ДНК. В наш час існує дуже багато векторів, сконструйованих на основі різноманітних плазмід і бактеріофагів.

Відносно складніше піддаються генетичні модифікації еукаріотичні мікроорганізми, до яких відносяться гриби, протисти, рослини і тварини. Найбільше значення як для біологічних виробництв, та для генетичних досліджень мають пекарські дріжджі Saccharommyces cerevisiae. Як і у бактерії, у них наявні плазміди, але використання їх в якості векторів часто являється не дуже ефективним. Тому для того, щоб виник стабільний трансформант, необхідні два послідовні явища: проникнення рекомбінантної ДНК в клітину і її інтеграція в хромосомну ДНК. Такий метод називається інтегративною трансформацією. В подальшому генно – інженерне конструювання у дріжджів пішло по шляху створення кільцевих плазмід з центромерами, особливими ділянками ДНК, забезпечуючи ми зв'язок з білками веретина поділу і, як наслідок, рівномірний розподіл таких плазмід між двома клітинами під час мітозу. Розвиток цього підходу призвело до створення цілих штучних міні – хромосом, які мають в собі. Окрім центромерного ділянки, теломери на кінцях, загнуті у вигляді булавки, і реплікатори – ділянки початку реплікації ДНК. Подібні міні – хромосоми можуть включати одразу декілька корисних генів, що забезпечує виробництво потрібної біотехнологічної продукції.

 




Поиск по сайту:

©2015-2020 studopedya.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.