Ексклюзійна хроматографія

Ексклюзійна хроматографія – це різновид рідинної хроматографії, у якій розділення компонентів базується на розподілі молекул відповідно до їхніх розмірів між розчинником, який знаходиться у порах сорбента, і розчинником, що протікає між його частинками. У процесі розділення невеликі молекули попадають у сітку полімера, в порах якого розчинник служить нерухомою фазою, і утримуються там, великі молекули не можуть проникнути в полімерну сітку і вимиваються із колонки рухомою фазою.Спочатку елююються найбільші, потім середні і далі невеликі молекули. Тому ексклюзійну хроматографію називають також молекулярно-ситовою. Ексклюзійна хроматографія підрозділяється на гель-пронакаючу і гель-фільтраційну. У гель-проникаючій хроматографії розділення здійснюється на полімерах, що набухли у органічних розчинниках; якщо ж полімери набухають у воді, то звичайно кажіть про гель-фільтраційний варіант.

Утримування молекул у цьому варіанті хроматографії визначається їхньою дифузією у пори сорбента і залежить як від розміру молекул, так і від розміру пор нерухомої фази. Якщо на механізм такого розподілу молекул не накладаються інші побічні ефекти, наприклад адсорбція або іонний обмін, то ізотерма розподілу є лінійною (тобто, концентрація у нерухомій фазі завжди є пропорційною до концентрації у рухомій фазі).

У даному варіанті рідинної хроматографії коефіцієнт розподілу D дорівнює !, очкільки рухомафаза і нерухома фаза, в порах якої знаходиться той же розчинник, має однаковий склад. Ця умова витримується для найменших молекул, які рухаються через колонку повільніше.

Основне рівняння колонкової хроматографії V_R = V_m + DV_s при D = 1 набуває вигляду

V_R = V_m + V_s.

З цього рівняння зрозуміло, що об’єм елюювання розчиненої речовини з малими розмірами молекул складається з вільного об’єму колонки V_m і об’єму розчинника, що знаходиться в порах нерухомої фази V_s. Молекули великого розміру, які не попадають в пори нерухомої фази, елююються з колонки разом з рухомою фазою, для них D = 0, а V_R = V_m.

Всі молекули дослідуваної суміші повинні вимиватись з колонки при пропусканні невеликого об’єму розчинника від V_m до V_m + V_s і розділення закінчується до виходу піка розчинника_. Тому в цьому виді хроматографії завжди необхідно використовувати достатньо довгі колонки з великим вільним об’ємом колонки V_m і великою кількістю пор в сорбенті.

При аналізі багатокомпонентних сумішей часто використовують дві, інколи чотири послідовно з’єднані колонки.

Нерухомі фази у ексклюзійній хроматографії вибирають для вирішення конкретних аналітичних завдань. Спочатку встановлюють, яка система розчинників може бути використана для аналізу (водна або водно-органічна), що визначає тип сорбента. Так, наприклад, розділення водних сумішей проводять на зшитих декстранах (сефадекс) або поліакриламіді (біогель Р). З органічними розчинниками розділення проводять на гідрофобних полістиролах з різним ступенем зшивки (стирогель, порагель, биобид С). Подібні гідрофобні гелі мають добру розділяючу здатність тільки в тих випадках, якщо полімер набухає в органічному розчиннику. Такі набухлі гелі нестійкі при дії тиску, швидкість потоку дуже мала. Для ексклюзійної хроматографії при високому тиску колонки заповнюють стійкими до тиску нерпухомими фазами з жорсткими матрицями – силікагелями. Недолік таких сорбентів – висока адсорбційна активність, яку можна знизити силанізацією поверхні або вибором відповідного елюента, який підходить за полярністю. Наприклад, використовуючи як рухому фазу метиленхлорид або тетрагідрофуран, на силікагелі можна розділити за молекулярними масами полістироли.

Рухомі фази у ексклюзійній хроматографії повинні відповідати певним вимогам, головна з яких – повне розчинення зразка, добре змочування сорбента, попередження адсорбції, низька в’язкість і токсичність.

Афінна хроматографія

Назва “афінна хроматографія” була запропонована для відносно нового і ефективного хроматографічного методу, в якому спорідненість відіграє особливо важливу роль. Описуваний метод базується на специфічній взаємодії, характерній для деяких біологічних та біохімічних процесів. Ця взаємодія відбувається між парами речовин, які реагують в розчині з високою вибірковістю. Так, наприклад, антиген та антитіло специфічно зв’язуються між собою, фермент реагує тільки зі своїм субстратом або з інгібітором, транспортна рибонуклеїнова кислота “вибирає” тільки ту амінокислоту. яку вона можк перенести всередину рибосоми, гормон реагує з відповідним рецептором. Якщо одна із цих сполук. яка відноситься до будь-якої з перерахованих пар, утримується ковалентним зв’язком на відповідному носії і при цьому зберігає свої властивості (специфічні характеристики), то подібний десолюбілізований препарат можна використовувати для вибіркового зв’язування із розчину другої сполуки пари. Якщо перемішати десолюбілізований препарат (у вигляді частинок з розчином суміші декількох речовин, то при цьому препарат зв’язує тільки один певний компонент. Отриманий препарат звільняють від супутніх речовин фільтруванням або центрифугуванням. промивають і відповідним чином виділяють необхідну сполуку.

Якщо ввести десолюбілізований препарат в хроматографічну колонку і повільно пропускати через неї розчин, то потрібний компонент зв’яжеться і буде утримуватись у колонці. Після промивання колонки відповідною десорбуючою рідиною можна вибірково елюювати цей компонент. За своїм апаратурним оформленням і за методикою весь процес подібний до інших методів колонкової хроматографії.

Поиск по сайту: