Выделение ДНК из образцов

Для наглядности опыта рекомендуется использовать для анализа продукты, содержащие в своем составе сою или кукурузу.

В среднем выполнение данного этапа занимает 35 мин.

Оборудование и реактивы:

Процедура выделения:

1. За 30 мин. до начала работы установите водяную баню на 95-100 ° C и запустите ее нагревание.

2. Добавьте по 500 мкл раствора InstaGene ™ в каждую пробирку с винтовой крышкой (всего 16 шт.), используя пластиковые пипетки или автоматические дозаторы. С помощью пипетки или дозатора несколько раз осуществите перемешивание раствора. Далее промаркируйте половину пробирок разметкой «неГМО» (8 шт.), а вторую половину (8 шт.) – «ТЕСТ» (для анализа продукта исследования).

3. Добавьте по 25 мл дистиллированной воды в стаканы и промаркируйте их.

4. Подготовьте к использованию «сертифицированный контроль пищевых продуктов без ГМО Bio-Rad» (контрольный образец, не содержащий ГМО).

5. Взвесьте на весах 0,5-2 г контрольного образца Bio-Rad и переместите его в ступку с пестиком.

6. Используя пластиковую пипетку, добавьте необходимое количество воды в ступку с контролем. Расчет количества воды, которое необходимо добавить, ведут по следующей формуле:

Масса контрольного образца, г × 5 =_____ мл

7. При помощи пестика разотрите контрольный образец вместе с водой до кашицеобразного состояния.

8. Добавьте 5 мл дистиллированной воды и продолжайте перемешивание.

9. При помощи пластиковой пипетки произведите отбор 50 мкл полученной суспензии и добавьте это количество к раствору InstaGene ™ в пробирку, промаркированную как «неГМО». Перемешайте содержимое в пробирке.

10. Вымойте ступку моющим средством с детергентом. Высушите ее.

11. Повторите пункты 5-7 с образцом продукта, взятого для анализа.

12. При помощи пластиковой пипетки произведите отбор 50 мкл полученной суспензии и добавьте это количество к раствору InstaGene ™ в пробирку, промаркированную как «ТЕСТ». Перемешайте содержимое в пробирке.

13. Поместите пробирки, промаркированные «неГМО» и «ТЕСТ» на водяную баню (95-100 ° С). Инкубируйте в течение 5 мин.

14. После завершения инкубации переместите пробирки в микроцентрифугу. Центрифугирование необходимо проводить на максимальной скорости в течение 5 мин.

15. Поместите пробирки в холодильник до дальнейшего использования.

Проведение ПЦР.

В среднем выполнение данного этапа занимает 45 мин.

Оборудование и реактивы:

Процедура проведения ПЦР:

Предварительная подготовка:

Примечание: все компонент перед использованием необходимо перемешивать при помощи центрифугирования!

Пункты 1-9 выполняются за 30 минут до начала постановки ПЦР

1. Добавьте по 50 мкл положительного ГМО-контроля в 8 пробирок с винтовой крышкой и промаркируйте их «ГМО+». Данный этап может быть осуществлен заблаговременно при условии, что пробирки будут храниться при -20ºС (срок хранения не более 2 месяцев)

2. Промаркируйте оставшиеся пробирки с винтовой крышкой:

1 шт. – «РР-1» (раствор для определения растения)

1 шт. - «ГМО-1» (раствор для определения ГМО)

8 шт. – «РР»

8 шт. - «ГМО»

3. Добавьте по 600 мкл раствора для ПЦР в пробирку «РР-1» и в пробирку «ГМО-1».

4. Добавьте 12 мкл раствора праймеров ФСII для определения растений (зеленый флакон) в пробирку «РР-1» и перемешайте. Храните полученную смесь на льду.

5. Добавьте 12 мкл раствора ГМО-праймеров (красный флакон) в пробирку «ГМО-1» и перемешайте. Храните полученную смесь на льду.

6. Отбирая из пробирки «РР-1» по 70 мкл, заполните оставшиеся 8 пробирок с маркировкой «РР».

7. Отбирая из пробирки «ГМО-1» по 70 мкл, заполните оставшиеся 8 пробирок с маркировкой «ГМО».

9. Для анализа одного образца вам понадобится три пробирки: 1 ««ГМО+», 1«ГМО», 1«РР». Все пробирки должны располагаться на льду.

Постановка ПЦР (для одного образца):

10. Промаркируйте ПЦР пробирки следующим образом:

11. Поместите кждую промаркированную пробирку в держатель и перенесите держатель с пробиркаи на лед.

12. Используя стерильные наконечники наполните пробирки согласно таблице. Во избежание образования осадка, перемешайте содержимое пробирок.

13. Поместите пробирки в термоциклер и установите режим проведения ПЦР, исходя из таблицы:

Электрофорез ПЦР-продуктов:

Предварительная подготовка:

Для проведения электрофореза полученных ПЦР-продуктов требуется приготовление 3% агарозы.

Оборудование и реактивы:

1. Разморозьте флаконы с G-оранжевым красителем и маркером молекулярных масс. После размораживания тщательно перемешайте их содержимое.

2. С помощью дозатора отберите 40 мкл G-оранжевого красителя и добавьте его к раствору маркера молекулярных масс. Хорошо перемешайте полученный раствор.

3. Промаркируйте тестовые микропробирки следующим образом:

8 шт. – «ЛД»

8 шт. – «МВР»

4. Добавьте по 70 мкл красителя в каждую из 8 пробирок, промаркированных «ЛД» (в случае необходимости хранить в холодильнике не более двух месяцев).

5. Добавьте по 25 мкл раствора маркера молекулярных масс в каждую из 8 пробирок, промаркированных «МВР» (в случае необходимости хранить в холодильнике не более двух месяцев).

6. Приготовьте буфер для электрофореза и агарозного геля:

- подготовка буфера: исходный буфер для электрофореза в наборе требует пятидесятикратного разведения. Трех литров 1x TAE буфера хватает для заполнения восьми средних электрофоретических камер. Разведение исходного буфера осуществляют путем добавления 60 мл концентрата к 2,94 л дистиллированной воды.

- приготовление агарозного геля (3%): 3 г агарозы растворяют в 100 мл 1хТАЕ буфера для электрофореза (для заполнения 8 электрофоретических камерпотребуется 350 мл буфера). Растворение агарозы удобнее всего осуществлять в микроволновой печи, затем следует поместить колбу с расплавленным геле на водяную баню при 60 ° С.

Заливку геля в лоток электрофоретической камер следует осуществлять осторожно на глубину, приблизительно, 0,5 см. Выполнять электрофорез следует при напряжении в 100 В в течение 30 мин.

5. Приготовление красителя ДНК Fast Blast: растворить 1 мл исходного концентрата 500х Fast Blast в 499 мл дистиллированной воды, полученный раствор тщательно перемешать, а затем инкубировать в темном месте при комнатной температуре в течение 12 ч.

В случае если требуется использовать краситель сразу после приготовления (без периода инкубации) краситель следует разводить следующим образом: 100 мл концентрата 500х Fast Blast смешать с 400 мл дистиллированной воды. До использования колбу с красителем следует держать в темном местею

Дальнейшее окрашивание гелей будет осуществляться путем их погружения в раствор 100х Fast Blast в течение 5 минут. Каждая порция раствора красителя может быть использована до 7 раз.

Проведение электрофореза:

6. Приготовьте камеру для проведения горизонтального электрофореза.

7. Извлеките ПРЦ-пробирки с продуктами реакции из термоциклера, аккуратно перемешайте содержимое в пробирках путем вращения и поместите их в держатели.

8. Используя стерильные наконечники, добавьте по 10 мкл G-оранжевого красителя (из пробирок промаркированных «ЛД») в каждую из пробирок с ПЦР продуктами. Хорошо перемешайте полученную смесь.

9. Далее при помощи дозатора заполните лунки агарозного геля по следующей схеме:

10. Запустите электрофорез со следующими параметрами: 30 мин при напряжении 100В

11. Окрасьте гель с помощью красителя Fast Blast (см. ниже).

4. Окраска и высушивание геля, анализ результатов:

Оборудование и реактивы:

Окраска и высушивание геля

1. Погрузите пластину геля в специальный лоток, заполненный красителем 100хFastBlast.

2.Выдержите пластину в красителе в течение 5 мин. При аккуратном перемешивании.

3. Перенесите пластину геля в большой промывочный контейнер и промойте его теплой водопроводной водой (40-55ºС). Промывание длиться не более 10 сек.

4. Повторите промывание 3 раза при постоянном перемешивании. Необходимо добиться полного обесцвечивания пластины геля.

5. После завершения процедуры промывания, гели необходимо высушить, обернув их целлофаном:

- предварительно смочите 2 листа целлофана в емкости с водой (15-20 сек.).

- далее поместите один целлофановый лист в специальный контейнер для высушивания и уложите на него пластину геля. Оберните пластину геля целлофаном, избегая образования пузырьков и удаляя излишки воды. Уложите поверх гелевой пластины второй целлофановый лист и оставьте пластину геля высыхать в таком состоянии в течение нескольких часов.

Анализ результатов

6. Анализируя пластины геля, заполните таблицу:

7. Сделайте выводы, исходя из данных таблицы.

ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Наличие или отсутствие на дорожке 5 полосы в 200 п.н. свидетельствует о том, что исследуемый образец не содержит ГМО.

Поиск по сайту: