Тема 19. Синтез нуклеотидів, їх похідних та флавінів

19.1 Біосинтез основ

Пурини.Синтез мононуклеотидів відбувається у всіх організмів за загальним шляхом. Однією із стадій є синтез основ. Досліди зі сполуками, що мають ізотопну мітку дозволили отримати дані про участь різних речовин у формуванні ароматичного пуринового кільця (рис. 19.1):

Рис. 19.1 Походження атомів пуринового кільця

5-фосфорибозил- 1-пірофосфат

Вихідною речовиною в біосинтезі пуринів слугує 5-фосфорибозил-1-пірофосфат (ФРПФ), який приймає γ-аміногрупу глутаміна та перетворюється в 5`-фосфорибозиламін (ФРА) (рис.23-2). Реакція каталізується фосфорибозилпірофосфат-амідотрансферазой. Наступна реакція ФРА з гліцином приводить до утворення гліциномідорибонуклеотида (ГАР) – сполучення нуклеотидної природи, в якому амідна група знаходиться в положенні, яке звичайно займає пуринова або піримідинова основи. Реакція ГАР з глютаміном веде до синтезу формілгліцинамідінрибонуклеотида (форміл - ГАМ).

Після замкнення кільця утворюється імілазолмістка сполука 5- аміноімідазолрибонуклеотид (АІР). При карбоксилюванні цієї сполуки формується рибонуклеотид 5-аміноімідазол- 4- карбонової кислоти (карбокси- АІР). Потім утворюється відповідний амід, 5-аміно-4-імідазол-карбоксиамідрибонуклеотид (АІКАР). Остання сполука уявляє собою продукт двох реакцій, які протікають через утворення проміжної сполуки – 5-аміноімідазол-4-сукцинокаркарбоксамідрибонуклеотида (сукцино- АІКАР). Завершується побудова пуринового кільця в реакції з N- формілтетрагідрофолівою кислотою, формільна група якої приєднується до 5-аміногрупи імідазолкарбоксамід-рибонуклеотида. Утворений рибонуклеотид уявляє собою інозинову кислоту (інозит-5`-монофосфат, ІМФ ), та є попередником усіх інших пуринових нуклеотидів.

Амінування ІМФ у АМФ відбувається у дві стадії з утворенням у якості проміжного сполучення аденілоянтарної кислоти (аденілсукцината) (рис.23-3). Утворення ГМФ з ІМФ також є двостадійною реакцією , в ході якої спочатку утворюється ксантозін-5`-монофосфат (КМФ), потім відбувається його амінування та утворення ГМФ (рис.19-4). Обидва пуринових нуклеотиди, АМФ та ГМФ, фосфорилюються кіназами , проходять стадію

Рис. 19-3. Реакція утворення аденілової кислоти з інозинової

утворення дифосфатів та перетворюються в АТФ та ГТФ:

АТФ+АМФ=АДФ+АДФ

аденілаткіназа

АТФ+ГМФ+АДФ+ГДФ

гуанілаткіназа

АТФ+НДФ=АДФ+НТФ

нуклеозиддифосфаткіназа

Фосфорилювання пуринових мононуклеозидфосфатов

Піримідини.Вихідними речовинами, які приймають участь в синтезі піримідинових нуклеотидів, слугують аспарагінова кислота та карбамоїлфосфат, які під дією аспартат-карбамоїлтрансферази перетворюються в карбамоїласпартат (рис. 23-5).Після замикання піримідинове кільце підлягає дії дигидрооротази, в результаті утворюється дигідроортова кислота. В НАД-залежній реакції відбувається відщепленя двох атомів водню, при цьому формується молекула оротової кислоти. Вслід за цим в реакцію вступає 5-фосфорибозил-1-пірофосфат (ФРФФ), яка є, як було відмічено вище, важливим проміжним метаболітом в синтезі нуклеотидів. Відбувається пірофосфорилазна реакція, в ході якої до ортової кислоти приєднається рибозо-5-фосфат, що присутній в сфері реакції як структурний компонент ФРФФ. В результаті утворюється оротидин-5`- моно фосфат (ОМФ) та вивільняється неорганічний пірофосфат.

Рис. 19-4. Утворення ксантозин- та гуанозинфосфатів

Декарбоксилювання оротидин-5`-монофосфата призводить до утворення уридин-5`-монофосфата призводить до утворення уродин-5`-монофосфата (УМФ), попередника інших піримідинових нуклеотидів. У подальшому в присутності кіназ УМФ перетворюється спочатку в уродин-5`-дифосфат (УДФ), а зтем в уродин-5`- три фосфат (УТФ). Перетворення урацилу в цитозин відбувається на рівні нуклеозидтрифосфатів та здійснюється під дією ЦТФ-синтетази:

Рис.19-5. Схема біосинтезу піримідинів

19.2 Мікробіологічний синтез нуклеозидфосфатів

Мікробіологічний синтез нуклеотидів та їх похідних входить у життя в силу необхідності мати ці специфічні сполучення у повсякденній практичній діяльності. Перші кроки були пов’язані з необхідністю мати природні сполучення , що придають смак та аромат харчовим продуктам. До сих пір однією з перспективних сфер їх застосування розглядається штучна їжа. Нуклеотиди та їх похідні можуть застосовуватися як лікувальні препарати, заповнюючи недолік у них того або іншого організму, особливо у якості кофакторів або коферментів. Широко використовуються вони в лабораторній біохімічній практиці.

Мікробіологічний синтез нуклеотидів відрізняється від багатьох класичних ферментаціонних процесів необхідністю вносити в середовище метаболічні попередники синтезуючих продуктів. У ряді процесів мікробні клітини виконують функції носіїв певних ферментних активностей, забезпечуючи синтез. Тут процеси росту клітин та синтезу продукта роз’єднані. Поряд з мікробіологічним синтезом нуклеотидів в їх різних похідних видове місце можуть займати ферментативні перетворення одних нуклеотидів в інші, а також ензиматичне розщеплення нуклеїнових кислот з наступним фракціонуванням отриманих продуктів гідролізу.

Аденозинтрифосфорна кислота. (АТФ). Отримання аденозиндифофата та аденозинтрифосфатаз засноване на здійснені культурою мікроорганізма реакції фосфорилювання аденіну або аденілової кислоти (5`-АМФ).

Культура Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872, що використовується, росте на середовищі, яке містить глюкозу високої концентрації, сечовину, дріжджовий екстракт, солі фосфору, магнію, кальцію та біотин. По ходу культивування вносять аденозин, який підлягає ензиматичному фосфорилюванню з утворенням аденилової кислоти, АТФ та АДФ. В аналогічних умовах культивування, але при внесенні гуанозину можна отримати гуанілову кислоту, ГДФ та ГТФ. Фосфорилюючим агентом виступає в сполучених реакціях АТФ. Накопичити її в сфері реакції без передачі на акцепторну молекулу внесеного ззовні аденозину не вдається.

Іншим мікробним джерелом ферментативних систем, що здійснюють фосфорилювання 5`-АМФ, можуть слугувати хлібопекарські дріжджі, взяті у вигляді гомогената або ацетонового порошку. Реакційна суміш містить 5`-АМФ, глюкозу, фосфатный буфер (рН 7,0) та дріжджі, підготовлені, як було сказано вище. Реакція протікає доволі швидко, без струшування, при 37С (рис.23-6). Вслід за виснаженням глюкози, при мінімальній кількості неорганічного фосфору відмічається максимум вмісту АТФ. За досягнення максимума АТФ спостерігається його розпад по АДФ та АМФ при одночасному підвищення рівня неорганічного фосфору. На вихід продукту суттєвий вплив оказує концентрація фосфата, що присутній у вигляді фосфатного буфера. Відхилення від якоїсь оптимальної величини може привести до ряду небажаної реакції на молекуле субстрату та викликати утворення інозинової кислоти та гіпоксантину.

Запропонована наступна схема фосфорилювання АМФ:

В процесі гліколіза має місце фосфорилювання АДФ в АТФ. Одночасно може відбуватися ряд інших реакцій.

Зокрема, під дією нуклеотидази аденилова кислота може розкладатися до аденозину та неорганічного фосфату. Аденозин, в свою чергу, завдяки активності аденозинкінази підлягає фосфорилюванню з утворенням АМФ та АДФ. Внаслідок відзначених вище взаємних переходів важко довести послідовність цих реакцій.

Імовірно, внесена ззовні аденілова кислота потрібна для виконання «затравочної» реакції. Очевидна необхідність мати в сфері реакції високу концентрацію глюкози та збалансована кількість фосфату. В аналогічних умовах фосфорилюються ГМФ, ЦМФ та УМФ.

Тривалість інкубації

Рис. 19-6. Фосфорилювання 5`-АМФ зруйнованими

клітинами хлібопекарських дріжджів

По дещо іншому шляхові відбувається синтез АТФ, коли в середовище для культивування вводять аденін. В цьому випадку ключовою реакцією повинна бути N-рибозидація аденіну. Процес звичайно проводять як типову аеробнк ферментацію з додаванням попередника. Продуцентами можуть слугувати Brevibacterium ammoniagenes та Corynebacyerium sp. Тут також необхідно мати середовище з глюкозою високої концентрації. На першому етапі синтезу відбувається утворення АМФ за рахунок внесеного в кінці експоненціальної фази росту культури аденіну та синтезованого клітиною 5`-фосфорибозил- 1`-пірофосфату (ФРФФ, 5-фосфо-α-D-рибозо-1-дифосфат). Реакцію здійснює аденінфосфорибозилтрансфераза:

ФРФФ+аденін=АМФ+ФФ_н

Подальший процес відбувається так же, як показано вище для АМФ. В результаті реакції, що відбувається між рибозо-5-фофатом (Р-5-Ф) та АТФ в клітинах утворюється ФРФФ. Реакція відбувається при АТФ: D-рибозо5-фофат пірофосфаттрансферази. АТФ та Р-5-Ф утворюються в результаті катаболізма глюкози. Р-5-Ф – в ході функціонування ГМФ-шляху, а АТФ – як продукту гліколізу. (рис. 23-7).

Тут же може мати місце надсинтез відповідних нуклеозидфосфатів із відмінних від аденіну основ: гуаніну, гіпоксантину, ксантину, урацилу, 6-меркаптопурину, 8-азагуанину, 4-тіоурацилу.

В останні роки викликає інтерес синтезу АТФ або його регенерація за участі іммобілізованих ферментів, які виділені із мікроорганізмів, або імобілізованих мікробних клітин. Одна з ферментних систем, карбамілфосфокіназа, була виділена з культури Streptomyces faecalis та іммобілізована на алкіл амінному пористому склі за присутності глутарового альдегіду. Для регенерації АТФ із АДФ розчин останньої на фосфатному буфері (рН 5,5) за присутності солі магнію пропускали через колонку.

В іншій системі синтезу АТФ з АМФ клітини Saccharomyces cervisiae були іммобілізовані шляхом їх механічного включення в поліакриламід ний гель або мікрокапсулюванням в етилцелюлозу. При мікрокапсулюванні вдається іммобілізувати на одиницю об’єму в 5-6 разів більше клітин та зберігати в 4-5 раз більш високу ферментативну активність. При безперервному отриманні АИФ з АМФ активність препарату хоча і знижувалася з часом, але складала більш 50% від вихідної через 10 днів.

Інозинова кислота.Відомі два шляхи мікробіологічного синтезу іозинової кислоти, один з них – з використанням метаболічного попередника, нуклеозида. При іншому методі необхідно мати ауксотрофний мутант, оскільки відомо, що інозинова кислота уявляє собою метаболічний попередник важливих пуринових нуклеотидів – аденілової та гуанілової кислот.

Рис. 19-7. Схема реакції синтеза АТФ з аденілу

АТФ1-молекули з’єднання, що йдуть на процес пірофосфорилювання Р-5-Ф, аденілаткіназну реакцію та інші можливі реакції, АТФ2- молекули з’єднання, що накопичуються в середовищі в результаті над синтезу: Е1- АТФ. D-рибозо-5-фосфат пірофосфотрансфераза, Е2 – аденін фосфорибозилтрансфераза. Е3- аденілаткіназа, Е_ГП – ферменти гліколітичного та пентозофосфатного шляхів.

При здійсненні першого з названих способів в сферу реакції вводять нуклеозид – інозит та джерело ферменту, фосфорилюючий інозит в 5`-положенні рибозного залишку. Джерелами фосфорилюючого ферменту - нуклеозиддифасфаттрансферази можуть слугувати багато мікроорганізмів, шо відносяться до родів Flavobacterium, Serratia, Staphilococcus, Pseudomonas. Донорами фосфору в цій реакції можуть бути нуклеотиди, а також неприродні з’єднання: н-нітрофенілфосфат (н-НФФ), бензилфосфат, фенілфосфат. У нашій крані в якості джерела фосфорилюючого ферменту запропонований один із штамів Pseudomonas trifolі. Культуру попередньо вирощують на середовищі, що містить глюкозу, пептон, дріжджовий екстракт. В якості ферментного препарату, що здійснює реакцію, використовують живі клітини, клітини, які висушені під вакуумом або ацетоном, а також заморожені клітини, оскільки локалізація ферменту внутрішньоклітинна. З названих вище донарів фосфату кращим враховується п-нітрофенілфосфат. Реакція відбувається ацетатном буфері при рН 4,0 за присутності іонів міді та цинку, помітно збільшуючий вихід готового продукту.

Найбільш важливими факторами, що визначають активність реакції фосфорилювання інозину, є концентрація донора фосфата, акцептора (інозину) кількості клітин використаної культури. При оптимальних співвідношеннях п-НФФ та інозиту клітини Ps. trifolі можуть фосфорилювати до 90 % інозиту в реакційній суміші. Вихіінозинової кислоти може бути підвищений, якщо до реакційної суміші додати ПАР, зокрема різноманітні твіни. Їх концентрації повинні бути підібрані дослідним шляхом.

Як і у всіх інших випадках, коли в якості ензиматичних препаратів використовують клітини мікроорганізмів, виникає необхідність оцінити активність ферментів при деградації цільових продуктів синтезу. В даному небажані для інозинової кислоти активні фосфомоностераза та 5`-нуклеотидаза. Якщо неможливо подавити їхню активність інгібіторами, то потрібно вибирати умови, при яких вона буде найменшою. В першу чергу до таких умов, найбільш легко регулюючим, відноситься температура та РН середовища, де відбувається реакція.

Інозинову кислоту виділяють у вигляді солі барію та шляхом іонообмінної хроматографії. Як було сказано вище, одним із способів отримання інозинової кислоти є її синтез мутантними штамами з певними генетичними порушеннями регуляторних механізмів, що веде до над синтезу продукту. В якості продуцентів застосовують аденілові ауксотрофи Brevibacterium ammoniagenes. Для них є характерною низька величина нуклеотиддеградуючої активності. Однією з найважливіших особливостей таких культур повинна бути добра проникливість клітин для викиду в навколишнє середовище ряду внутрішньоклітинних метаболітів. За уявленнями, інозинова кислота, що синтезується в клітинах, розкладається в них, утворюючи основу – гіпоксантин, який потім виходе з клітини. Ресинтез інозинової кислоти відбувається поза клітиною. Для його здійснення треба мати рибозо-5- фосфат та АТФ. Синтез інозинової кислоти відбувається в даному випадку згідно механізму, який описаний вище для АМФ, через утворення ФРФФ. Реакцію здійснює гіпоксантинфосфорибозил-трансфераза:

Одна з умов порушення клітинної проникності для більшості відомих продуцентів інозинової кислоти є нестача марганцю в середовищі. Чутливість таких штамів до іонів марганцю робить неможливим їх використання в промислових умовах, так як сировина для середовищ звичайно містить значну кількість іонів двохвалентних металів, зокрема марганцю. У СРСР в ВНДІгенетика отриманий мутант, стійкий до іонів марганцю. Для заповнення дефіциту аденіну не виникає необхідності вводити його в середовище для культивування. Використання кукурудзяного екстракту у якості одного з компонентів середовища заповнює потребу штаму в аденіні. Останній контролює синтез інозинової кислоти за типом негативного зворотнього зв’язку на одному з початкових етапів біосинтезу пуринових основ. Абсолютна величина концентрації аденіну для оптимального ходу процесу залежить від ряду факторів: температури, рівня аерації, вмісту неорганічного фосфату, наявності гістидину та ін.

Крім мікробіологічного (ферментативного) синтезу інозинової та гуанілової кислот можлива комбінація мікробіологічного та хімічного синтезу. При використанні дефіцитного по аденіну мутанту Bacillus subtilis в середовищі накопичується інозит, а у випадку пурин-дефіцитного мутанту Bac. megaterium – 5`-фосфорибозил – 5-аміно-4-імідазол-карбоксамід (АІКАР). Подальші етапи здійснюються шляхом хімічних перетворень:

1) інозин→2`-3`-О-ізопропілдієнінозин→2`-3`-О-ізопропілдієнінозин 5`-фосфордихлорид→5`-ІМФ;

2) АІКАР→2-меркаптоінозин→гуанозин→5`-ГМФ.

Нікотинамідаденіндинуклеотид (НАД).Мікробіологічний синтез відбувається шляхом культивування продуценту Brevibacterium ammoniagenes з попередником. Вирощування продуценту рекомендують проводити на середовищах, що містять глюкозу, сечовину, дріжджовий екстракт, фосфати, солі магнію, кальцію та біотин. Попередниками НАД в середовищі можуть бути нікотинова кислота або нікотинамід, а також аденін. Попередниках в умовах дослідження звичайно вводять на другу добу росту культури (рис.23-8). При цьому на п’яту добу в середовищі накопичується з перевагою НАД, а також АМФ, АДФ та АТФ.

Час, доба

Рис.19-8. Динаміка накопичення НАД при

культивуванні Brevibacterium ammoniagenes.

1-біомаса, 2-НАД, 3-рН середовища

В цей час культура вступає в фазу стаціонарного росту. Крім вказаних речовин в середовищі міститься проміжний продукт синтезу НАД-нуклеотид нікотинової кислоти. Безпосередньо в синтез включається нікотинова кислота, тому, якщо в середовищі вводять її амід, відбувається ферментативне дезамінування з утворенням кислоти. На рис.23-9. подано схему синтезу, де фосфорибозилпірофосфат позначений ФРФФ, а залишки фосфорної кислоти в нуклеотидах - Ф. На цій схемі показана ще одна реакція, в результаті якої утворюється фосфорильоване похідне НАД – нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат. Реакцію здійснює НАД-кіназа, що передає фосфорний залишок від АТФ на НАД. Для отримання НАДФ запропонована також система, в якій в якості ферментного препарату використовується безклітинний екстракт Rroteus mirabilis, а фосфорилюючим агентом виступає п-нітрофеніл.

У СРСР розроблений синтез НАД в культурі хлібопекарських дріжджів. Дріжджові клітини використовують фактично як мікрореактори для синтезу НАД з попередників за присутності джерела енергії. Система складається із суспензії дріжджових клітин (50%) у розчині, що містить фосфати, солі магнію, аденін та нікотинамід в якості попередників, а також глюкозу і екстракти хлібопекарських дріжджів або кормових дріжджів. При цьому в порівнянні з вихідною кількістю НАД збільшується в 10 разів. Потім відбувається екстракція НАД з клітин та виділення його шляхом іонообмінної хроматографії.

Фосфорильоване похідне – НАДФ отримують, як було сказано вище, за рахунок НАД-кіназної реакції. Джерелом ферменту можуть слугувати іммобілізовані в поліакриламідному гелі клітини мікробної культури Achromobacter aceris. Іммобілізовані та вільні клітини утворюють максимальну кількість НАДФ при рН 7,0 та температурі 45С. Однак іммобілізовані клітини на відміну від вільних повільніше втрачають активність в лужному середовищі та при підвищених температурах. Колонка з імобілізованими клітинами втрачає 50% активності після 20 діб роботи, а вільні клітини – вже через 6 годин.

Гуанозинполіфосфат.В останні роки серед продуктів обміну мікроорганізмів речовин нуклеотидної природи знайдені гуанозинполіфосфати. Переважно це тетра- або пентафосфати. Вони виконують функції регуляторів в багато чисельних біохімічних реакціях, тому можливість препаративного отримання їх заслуговує уваги.

Накопичення гуанозинполіфосфатів знайдено у культурі Brevibacterium ammoniagenes, коли в реакційній суміші були присутні гуанозин-5`-монофосфатабо ксантозин-5`-монофосфат. Штам уявляє собою мутант, що потребує для свого вирощування присутності в середовищі дорогих для промислового виробництва компонентів таких, як дріжджовий екстракт, біотин, тіамін, пантотенова кислота та ін.

Рис. 19-9. Схема біогенезу НАД⁺ та НАДФ⁺ з нікотинової кислоти у якості метаболічного попередника

Ксантинін-5`-монофосфат є метаболічним попередником гуанілової кислоти, яка утворюється після амідування пуринової основи глютаміном за присутності АТФ.

Процес ензиматичного перетворення метаболічних попередників (Г-5`-Ф або Кс-5`-Ф) в нуклеозидполіфосфат відбувається в середовищі, що містить глюкозу, а також високий рівень фосфатів та магнію. Окрім полі фосфатів в середовищі накопичується 5`-ГМФ, 5`-ГДФ, 5`-ГТФ, однак гуанозинполіфосфати утворюються в більш вузькому інтервалі рН та при іншому температурному оптимумі:

Фермент АТФ нуклеотид пірофосфаттрансфераза, який здійснює перенесеня пірофосфатних залишків з АТФ на акцепторні молекули, був виділений з Streptomyces adephospholyticus.

Контрольні питання:

1. Розкрити загальні особливості біосинтезу азотистих основ

2. Охарактеризувати особливості синтезу інозинової кислоти

3. Охарактеризувати особливості синтезу нікотинамідаденіндинуклеотиду

4.Охарактеризувати особливості синтезу гуанозин поліфосфату

Тема 20. Синтез вітаміну В₁₂. Сукцинат-гліциновий цикл

20.1 Структура вітаміну В₁₂

Біосинтез вітаміну В₁₂ здійснюється культурами актиноміцетів і бактерій. Найбільший промисловий інтерес представляють пропіоновокислі бактерії, зокрема Propionibacterium shermanii. Вітамін утримується в клітинах пропіоновокислих бактерій протягом всього процесу ферментації. Найвища продуктивність бактерій по відношенню до вітаміну відмічається у молодої культури. Найбільша кількість вітаміну синтезується в анаеробних умовах культивування. Особливо шкідливий вплив на біосинтез вчиняє вирощування бактерій в аеробних умовах на початку культивування. Щодо росту, то в аеробних умовах бактерії накопичують не менше біомаси, ніж в анаеробних.

Як відомо, молекула вітаміну В₁₂ складається з двох частин: кобальт- місткої і нуклеотидної.

Порфериноподібна структура є хромофорною, для неї характерна наявність атому кобальту і цианогрупи, які утворюють координаційний комплекс. 4 з 6 лігандних положення цього комплексу зайнято 4ма атомами азоту тетрапіролподібної коринової кільцевої системи. Одна позиція з’єднана з азотом нуклеотидної основи, остання з названих позицій містить в якості замісника CN-групу. Коринова структура, як і всі порфірини, складається з 4 азотистих тетероциклів типу пірола, з’єднаних системою кон’югативних подвійних зв’язків. В цілому хромофорне ядро молекули вітаміну найбільш близьке за будовою до уропорферину ІІІ. Ця подібність особливо проявляється у відношенні природи і порядку розміщення бокових ланцюгів у пірольних кільцях. Однак у відмінності від порфіринів молекула вітаміну В₁₂ більш відновлена і містить 6 додаткових метильних груп, стабілізуючих відновлений стан всього макрокільця. Β-замісниками у молекулі вітаміну В₁₂ є аміди оцтової і пропіонових кислот, а не вільні кислоти. Кільця А і Д з’єднанні ковалентним зв’язком безпосередньо, а не через метиновий місток. Пропіонамід кільця містить ізопропаноламідний залишок, який є частиною нуклеотидного ліганду.

Нуклеотидне ядро складається з пуринової основи, рибози і залишку фосфорної кислоти. Нуклеотидне ядро з’єднується з кобальтом через азот основи і з кориновим кільцем – через амінопропаноловий місток, який звичайно виділяють як самостійний структурний елемент молекули. Пуринова основа з’єднана з рибозою незвичайним N-α-глікозидним зв’язком на відмінність від N–β-глікозидного зв’язку, який , як правило, зустрічається в цуклеозидах природних пуринів і піримідинів. Основа нуклеотиду, 5,6-диметилбензімідазол, не знайдена у інших природних сполуках, крім вітаміну В₁₂.

На відмінність від стабільного хімічного складу коринового кільця склад нуклеотидного ядра варіює. Наряду з вітаміном В₁₂, який називають цианкобаламін, можуть синтезуватися його аналоги окси-, хлоро-, сульфато-, нітритокобаламіни. Якщо в нуклеотидній частині молекули замість 5,6-диметилбензімідазолу міститься аденін, метиладенін, гіпоксантин або їх похідні, речовина не володіє біологічною активністю для людини і тварин. Його називають псевдовітаміном. Перевага отримання вітаміну В₁₂ за допомогою пропіоновокислих бактерій у порівнянні з отриманням цього вітаміну за допомогою актиноміцетів полягає у тому, що перші синтезують виключно істинний вітамін В₁₂.

Вивчення похідних вітаміну В₁₂, які синтезовані пропіоновокислими бактеріями, дозволило встановити, що він знаходиться в основному у так званій коензимній формі, яка складає до 75-85% суми кобамідів. Ці форми характеризуються тим, що місце ціаногрупи займає молекула 5´-дезоксиаденозину, приєднана до атому кобальту Со-С зв’язком.

Цианкобаламін не володіє коензимною активністю і після введення в організм людини повинен трансформуватися у свою коензимну форму. Однак при деяких патологічних станах організму цього перетворення не відбувається. Признано, що використання коензимної форми В₁₂ для медичних цілей більш виправдано, ніж ціанкобаламіну.

20.2 Сукцинат-гліциновий цикл

Структурна подібність коринового кільця молекули вітаміну В₁₂ і уропорферину ІІІ дозволила сформувати гіпотезу про загальні етапи біогенезу порфіринів і кориноїдів.

Синтез порфіринів тісно зв’язаний з продуктами циклу Кребса. В початкові реакції синтезу вступає янтарна кислота у вигляді похідної або α-кетоглутарова кислота. Сукциніл-КоА починає реакції, які Шемін назвав сукцинат-гліциновим циклом. Вихідною реакцією цього циклу є конденсація сукциніл-КоА з гліцином по його α-вуглецевому радикалу. Вважають, що продукт конденсації α-аміно-β-кетоглутарова кислота декарбоксилюється, в результаті утворюється δ-амінолевулінова кислота. Ферментна система, що здійснює ці перетворення, є піридоксальфосфат залежною. Згідно запропонованої схеми (рис.11-1) спочатку відбувається утворення стабілізованого карбонового іону при взаємодіі гліцину і піридоксальфофату через втрату протона. Потім проходить конденсація, при якій карбоніон взаємодіє з електрофільним карбоніл-вуглецевим атомом сукциніл-КоА.Ферментна система δ-АЛК-синтетази репресується киснем. Фермент синтезується тільки молодими клітинами. З віком синтетична властивість P. shermanii знижується, 96-годинна культура взагалі не утворює δ -АЛК.

Поряд з сукцинат-гліциновим циклом доведена можливість синтезу δ-амінолевулинової кислоти із α-кетоглутарової. В цьому випадку відбувається НАДН-залежне відновлення карбоксильної групи α-кетоглутарової кислоти з утворенням 4,5-диоксивалер’янової кислоти, потім переамінування цього продукту з L- α-аланіном до δ-амінолевулинової кислоти:

Наступним етапом синтезу є утворення монопіролу - порфобілиногену із двох молекул δ-амінолевулинової кислоти:

δ-АЛК-дегідратаза активується глютатіоном і цистеїном і інгібується солями важких металів і меркаптидами, що вказують на важливу роль SH-груп у каталізі δ-АЛК-дегідратаза має алостеричну природу. Активність її інгібується геном, кінцевим продуктом біосинтетичного шляху; вітамін В₁₂ не вчиняє інгібуючої дії.

Як видно, у аеробних мікроорганізмів основним джерелом сукциніл-КоА є окисне декарбоксилювання α-кетоглутарату, тоді як у анаеробів можливе переважне його утворення із сукцинату через сукциніл-КоА-синтетазну реакцію або через метил-малоніл-КоА-ізомеразну реакцію. Джерелом сукцинату може бути відновлення фумарової кислоти.

20.3 Заключні етапи біосинтезу вітаміну В₁₂

Суттєвий вклад у розшифрування заключних етапів біосинтезу молекули В₁₂ вніс В.Я. Биховський, який виявив раніше невідомі тетрапірольні пігменти – корифірини. Вони представляють собою метильовані похідні уропорфірину ІІІ, що несуть метильні групи в β-положеннях пірольних кілець і при вуглеводах α- або γ-метинових містків. У схемі біогенезу молекули вітаміну В₁₂ корифирин і його Со-похідна займають місце уропорфіриногеном ІІІ і кобіриновою кислотою.Таким чином, можна вважати, що у Propionibacterium shermanii працює система порфобіниноген → уропорфириноген ІІІ → корифірин → Со-корифірин → кобіринова кислота → вітамін В₁₂. Метилування уропорфіриногену ІІІ з можливим наступним декарбоксилюванням бокового ланцюжка оцтової кислоти при С-12 кільця С призводить до розходження подальших шляхів біогенезу гема і корину. Включення кобальту в молекулу метильного похідного (корифірину), що утворився, напевно, є необхідною умовою для його подальшого відновлення, що супроводжується додатковим метилюванням, з розривом метилового містка і виникненням прямого С-С зв’язку між кільцями А і D. Кобіринова кислота, яка при цьому утворилася далі піддається амілуванню, включенню аміноізопро-панольного залишку, нуклеотидної основи, що в результаті призводить до утворення вітаміну В₁₂ і його аналогів.

Метаболічним попередником нуклеотидної частини вітаміну (5,6-диметилбензимідазолу) є рибофлавін. Мічений рибофлавін і його попередник 6,7-диметил-8-рибітиллюмазин включається в кобаламін безклітинними екстрактами Propionibacterium shermanii. Розкладення рибофлавіну до 1,2-диаміно-4,5-диметилбензена відбувається в аеробних умовах, що пояснює необхідність аерації у другій половині ферментації, якщо процес ведуть без додавання попередника.

Рибітольна частина рибофлавіну не включається в рибозу. Є докази того, що нуклеотидна частина кобаламіну утворюється із вільного 5,6-диметилбензимідазола і рибозофосфату.

Достатньо складним і маловивченим є питання про механізми регуляції синтезу молекули вітаміну В₁₂ і речовин, що знаходяться на загальних шляхах біосинтезу. Встановлено, що гем здійснює координовану репресію ферментів, що каталізують утворення δ-АЛК порфобілиногену і уропорфіриногену ІІІ, пригнічуючи тим самим біосинтез як порфіринів, так і вітаміну В₁₂, для яких всі тири перераховані вище стадії є спільними.

Вітамін В₁₂ не впливає не ці ферменти, а його дія направлена на ензиматичні системи, що беруть участь в метилюванні молекул уропорфіриногену ІІІ. Цю репресію вчиняє лише нуклеотидомістка коензимна форма вітаміну, тому включення основи в молекулу вітаміну є одним із факторів регуляції. Для синтезу вітаміну необхідний іон амонію. Заміняти його можуть тільки амінокислоти, які піддаються інтенсивному дезамінуванню. В реакції амінування молекули вітаміну може приймати безпосередню участь глютамін. Амінуванню піддаються залишки оцтової і пропіонової кислот у ході формування молекули вітаміну В₁₂.

20.4 Утворення вітаміну В₁₂ при метановому бродінні

Окрім використання пропіоновокислих бактерій існує метод, що дозволяє застосовувати у якості продуцентів термофільні метанові бактерії. При метановому бродінні відбувається відновлення СО₂ або СО молекулярним воднем або воднем, що відщепляється від органічних речовин.

Процес накопичення вітаміну В₁₂ часто відбувається при знешкодженні міських стічних вод або стічних вод заводів, що перероблюють зерно і мелясу. Добрим субстратом для метанового бродіння є барда ацетоно-бутилових і спиртових заводів. В біохімічному перетворенні бере участь біоценоз бактерій, що складається, принаймні, із чотирьох фізіологічних груп, які ведуть взаємопов’язаний і складний процес розщеплення органічних речовин до вуглекислоти і метану. До цих груп відносяться вуглеводозброджуючі, амоніфікуючі, сульфат-відновні, метаноутворюючі бактерії. Високий вміст вітаміну в клітинах метаноутворюючих бактерій пов'язаний з його функцією у процесі утворення метану.

Контрольні питання:

1. Охарактеризуйте структурні особливості цианкобаламіну

2. Навести характеристику сукцинат-гліцинового циклу

3. Охарактеризувати особливості біосинтезу вітаміну В₁₂ в ході метанового зброджування

Поиск по сайту: