Тема 17. Мікробіологічний синтез пептидів

17.1 Низькомолекулярні пептиди, їх характеристика і функції в клітинах

Серед продуктів мікробіологічного синтезу пептиди широко розповсюдженні. За своєю будовою вони можуть лінійними полімерами, циклічними пептидами, лактонами; можуть входити до структури як складова частина при яких-небудь гетероциклічних фрагментах молекули. Для всіх пептидів характерна так званий пептидний зв'язок, тобто група

Вважають, що біосинтез деяких пептидів, наприклад тих поліпептидів, що відносяться до антибіотиків, складає частину вторинного метаболізму і тісно пов'язаний з диференціацією мікробної клітини. Для бактеріальних спороутворюючих культур синтез пептидів зв’язують з їх переходом до стаціонарної фази росту і споруляцією. З точки зору молекулярних процесів, що спостерігаються при цьому в клітині, більшість дослідників сходяться у думці, що відбувається блокада реакцій, пов’язаних з синтезом РНК. Відмічається, наприклад, повне пригнічення синтезу РНК тероцидином, коли закінчується вегетативний ріст продуценту – культури Bac. brevis.

Роль тироцидину in vivo, яка проявлюється при переході клітин у фазу спороутворення, полягає у блокаді ініціацій транскрипції РНК з метою виключення тих генів, активність яких необхідна лише на стадії вегетативного росту. Напевно, РНК-полімераза виявляється позбавленою можливості зв’язуватися з відповідною ділянкою ДНК. Існує дві точки зору на деталі цього механізму. Одна з пропонує конфірмаційні зміни молекули ДНК-залежної РНК-полімерази, що позбавляє фермент компліментарності до відповідної ділянки ДНК. Згідно другої точки зору молекула пептиду сама зв’язується з цією ділянкою, конкуруючи з РНК-полімеразою.

Серед низькомолекулярних пептидів, що продукуються мікроорганізмами, широко відомі депсипептиди, тобто пептиди, до складу яких поряд з α-аміно- входять α-оксикислоти: мембранні іонофори валіноміцин і еніатин – речовини, що здійснюють транспорт катіонів через клітинні мембрани. Велику групу складають низькомолекулярні пептиди у актиноміцетів, що володіють інгібуючою активністю по відношенню до протеаз. Найбільш відомі із цих пептидів – лейпептин, пепстатин, атипаїн. До їх складу входять низькомолекулярні кислоти жирного ряду, що не містять азоту. Можна припустити, що вони володіють функцією регуляторів в клітинах, що синтезують ці сполуки.

Ферментна система, що здійснює синтез низькомолекулярних пептидів, володіє відносно широкою субстратною специфічністю, на відміну від рибосомального синтезу білку. В результаті замість одного пептиду може синтезуватися група близьких за амінокислотним складом пептидів, що різняться однією-двома амінокислотами. Наприклад, в тироцидині В і С на відміну від тироцидину А фенілаланін заміщений на триптофан. Відомі чотири типи тироцидину і декілька типів актиноміцинів, в яких в пептидній частині різні замісники в двох положеннях ланцюга.

Крім протеїногенних амінокислот до складу молекули низькомолекулярних пептидів включаються метил-, окси-, дегідро- і імінопохідні; β-, ало-, ізо- і треоізомери, а також орнітин, диамінопропіонова, диаміномасляна кислота та ін.

В біосинтезі біологічно активних сполук, що містять крім пептидної частини інші компоненти, як, наприклад, феноксазинова структура актиноміцетів, координовано приймає участь декілька ферментних систем. Очевидно, існує загальний регулюючий механізм, що забезпечує одночасну функцію всіх ферментів, що приймають участь у синтезі молекули. Не дивлячись на велику інформацію про механізми біосинтезу молекул низькомолекулярних пептидів, було б помилково вважати, що відомі всі деталі, що пов’язані з функцією ферментних систем, що приймають участь у біосинтезі.

17.2 Біосинтез молекул низькомолекулярних пептидів

Вихідні структурні одиниці біосинтезу – амінокислоти, як правило, знаходяться в цитоплазмі клітини, складаючи її метаболічний фонд. У вільному виді вони представляють собою хімічно досить інертні сполуки, що володіють слабкими нуклеофільними властивостями. Активація амінокислот для синтезу пептидів відбувається так само, як і при біосинтезі білків: за рахунок ферментативної взаємодії між карбоксильною групою активованої амінокислоти і АТФ. Реакцію здійснюють аміноацилсинтетази, в результаті чого утворюється аміноациладенілат з виділенням вільного пірофосфату:

Амінокислота у вигляді аміноациладенілату переходить в електрофільну форму. Можна вважати, що сутність активації амінокислот полягає в перетворенні нуклеофільного реагенту в електрофільний.

В цій формі вони проявляють здатність до ферментативного переносу на який-небудь нуклеофіл (NH₂ –, OH –, HS- і т.д.).активована ацильна група переноситься до акцептору з одночасним виділенням АМФ. При біосинтезі пептидів характерною особливістю є утворення тиоефірного зв’язку з акцептором . За своїм енергетичним потенціалом тиоефіний зв'язок виявляється рівним фосфорильному зв’язку в АТФ. Перенос аміноацильних (Аа) груп з аденілату до толової групи ферменту відбувається при обмінній реакції АТФ – АМФ, яка протікає в присутності амінокислоти:

Наростання ланцюгу пептиду відбувається, як і при рибосомальному синтезі, від N-термінального кінця шляхом приєднання наступної амінокислоти до активованого С-кінця.

В білковому синтезі аміноациладенілат вступає в реакцію з т-РНК, приєднуючись до термінального залишку аденозину, утворюючи ефірний зв'язок через 2`- або 3`-гідроксильну групу. Ця реакція, що каталізується аміноацетил-тРНК-синтетазою, відрізняється специфіч-ністю. Аміноацил-тРНК-синтетази настільки тонко розрізнюють природні амінокислоти, що вірогідність помилки в умовах, що існують всередині клітини, значно менше 1 на 10000.

Таким чином, амінокислоти, які часто називають непротеїногенними, тобто такими, що не входять звичайно до структури білку, не можуть бути визначені аміноацил-тРНК-синтетазою і включені в білок (за дуже невеликими виключеннями). В молекулах низькомолекулярних пептидів, зокрема антибіотиків і інгібіторів ферментативних реакцій, такі амінокислоти зустрічаються значно часто. Однією із непротеїногенних амінокислот, що входять в молекулу дека пептиду граміцидину С, є L-орнітин. У ході синтезу пептиду відбувається утворення аміноацил-адинілату орнітину. Включення амінокислоти не відбувається, так як немає відповідної аміноацил-тРНК-синтетази.

Система синтезу пептидів істотно відрізняється від такої ж у білків. Головна відмінність заклечається в тому, що при синтезі пептидів первинна структура детермінова білковою матрицею, тоді як при синтезі білків – мРНК. Важливим для розуміння процесу біосинтезу низькомолекулярних пептидів служить представлення про механізм, який забезпечує присутність в молекулі D-форм амінокислот. Є достатня кількість фактів стверджувати, що вихідними метаболічними попередниками D-форм амінокислот в пептидах є L-форми. Уявлення про деталі процесу не у всіх відношеннях очевидні. Тим не менш можна вважати встановленим, що інверсія L-амінокислот при α-вуглецевому атомі не пов’язана з дезамінуванням. Рацемізація відбувається на рівні аденілового похідного, що зв’язаний з ферментом, або на рівні тіоефіру амінокислоти з ферментом. Обидва цих варіанти схематично показані нижче.

Приклад для L-фенілаланіну при синтезі граміцидину С. При елонгації пептидного ланцюга рацемізація, напевно відбувається на рівні пептидних напівпродуктів. Характерно, що тут замість перидоксильфосфату, коферменту в реакціях рацемізації, потрібна АТФ.

Відомо декілька мультиферментних комплексів, що синтезують низькомолекулярні пептиди. Вони забезпечують повний синтез полімеру, здійснюючи активацію амінокислот, рацемізацію і полімеризацію. В їх складі зустрічаються подібні ферментні системи, зокрема ті, які перетворюють L-ізомери в D-форми і є ініціаторами в синтезі молекул, наприклад фенілаланінрацемаза, що приймає участь в синтезі граміцидину С і тироцидинів.

Існує точка зору, що деякі D-амінокислоти можуть безпосередньо включатися в молекулу пептиду. Але цей факт все ж потребує доказів. Поки не описані ферментні системи, що забезпечують синтез активованих адинілових похідних D-амінокислот.

Оскільки рацемази амінокислот володіють властивістю до зворотності реакцій, є вірогідність, що при використанні методу «клітин, що знаходяться в спокої» спочатку відбувається рацемізація D-форм в L-форми. Далі амінокислота вступає в реакцію і потім переходить в D-форму. Такий варіант не виключає експериментальних даних, отриманих з міткою, вона залишається на своєму першому місці. У зв’язку з цим реальним доказом факту включення D-амінокислоти можуть приймати участь, але там працює інша ферментативна система синтезу. Так, при синтезі дипептиду, що містить два залишки D-α-аланіну, працює D-аланілаланінсинтетаза.

Як відомо, до складу клітинної стінки бактерій входить пептидоглікан, його пептидні залишки, що з’єднані з вуглеводним компонентом, мають поперечні зшивки. Синтез пентагліцину відбувається через утворення гліцин-тРНК, хоча рибосоми в біосинтезі участі, напевно не приймають. Вважають, що перший залишок гліцину з гліцин-тРНК передається на ε-аміногрупу залишку L-лізину, що входить до складу зв’язаного з ліпідом метаболічного попередника пентагліцину. Далі відбувається послідовне приєднання всіх інших залишків гліцину. Механізм нерибосомального синтезу пептиду за участю тРНК потребує експериментального підтвердження .

Залишається відкритим питання про механізми біосинтезу депсипептидів, до числа яких відносять раніше названі валіноміцин і еніатини. Зокрема, невідомо, як відбувається реакція утворення складного ефірного зв’язку між α-оксикислотами і α-амінокислотами, яким чином відбувається циклізація.

Граміцидин С. Синтез граміцидину С здійснюють два ферментних білки, які мають молекулярну масу 280000 (фракція 1) и 100000 (фракція 2).

Фермент з більшою молекулярною масою зв’язує 4 молекули АТФ та чотири амінокислоти: L-пролін, L-валін, L-орнітин та L-лейцин. Амінокислоти утворюють аміноациладенілати L-про-АМФ; L-вал- АМФ; L-орн-АМФ; L-лей-АМФ; потім амінокислотні залишки, які отримали енергію від гідролізу АТФ, переносяться на SH-групи того ж ферменту, очевидно, на SH-групи цистеїну. Амінокислоти не конкурують за фермент, оскільки фермент має чотири незалежних активних центри, кожний з яких приймає участь в активації тільки однієї визначеної амінокислоти.

В такому стані фракція 1 здатна будувати поліпептидну молекулу після того, як фракція 2 з меншою молекулярною масою ініціює цей процес. Фракція 2 уявляє собою фенілаланінрацемазу (АТФ-гідролізуючу). Ферментативний акт починається з синтезу L- фенілаланінаденілату, амінокислотний залишок якого переноситься на SH-групу ферменту. Вище наведені приклади два можливі варіанти механізмів рацемізації. Відносно того, де відбувається рацемізація L- фенілаланіну, існує дві взаємовиключні точки зору.

Власне ініціація починається з переносу активованого залишку D-фенілаланіну з фенілаланінрацемази на аміногрупу залишку L-проліну, що знаходиться на ферменті Е₁ . Усі подальші перетворення при побудові молекули граміцидину С супроводжуються утворенням фракції 1 та складаються з однакових послідовних реакцій. Сутність їх полягає у перенесенні пептиду, що будується, на аміногрупу наступного амінокислотного залишку. Для полімеризації в цьому стані не потрібні ніякі додаткові білкові сполуки та джерела енергії. Оптимум рН біосинтезу пептиду на Е₁ складає 7,8 що приблизно відповідає рН аміногруп амінокислотних залишків, які знаходяться на ферменті. На стадії утворення тіоефіру пентапептиду реакція зупиняється. Останній етап синтезу відбувається на молекулі того ж ферменту Е₁; він заключається в реакції конденсації пентапептидів в циклічний декапептид в результаті антипаралельної реакції подвоєння, яка відбувається між двома пентапептидними субодиницями.

Детальний аналіз процесу, який відбувається на молекулі Е₁, показав, що пептид, який будується пов’язаний тіоефірним зв’язком з 4`-фосфопантотеїном:

Виявилося, що фосфопантотеїн приймає участь в перенесенні пептиду з SH-груп білку в процесі його елонгації. За аналогією з біосинтезом вищих жирних кислот, у яких проміжні ацильні залишки активовані утворенням тіоефірного зв’язку з фосфапантотеїном, запропонована схема побудови молекули граміцидину С. Згідно цій схемі, дипептид D-фен-L-про з SH-групи підлягає транстіолуванню на SH-групу фосфопантотеїну, молекула якого «протягнута» з центру ферменту до її периферії, куди звернена SH-група. Якщо розглядати цю схему як чисто механічну модель, то можна вважати, що пептидилфосфопантотеїн, повертаючись по колу навколо деякої умовної центральної вісі ферменту до наступної аміноацил-S-групи, переносе пептид по поверхні ферменту. У результаті пептид з фосфопантотеїну переноситься на аміногрупу аміноацилферменту, утворюючи пептидний зв’язок.

Так, в молекулі граміцидину С послідовно відбувається перенос дипептиду D-фен-L-про на залишок L-валіну, потім перенесення утвореного трипептиду на L-лейцин. Одним з регулюючих факторів при синтезі граміцидину С є наявність у сфері реакції АМФ, який слугує конкуруючим по відношенню до АТФ інгібітором при утворенні аміноациладенілатів, що переконливо показано в опитах в присутності L-валіну.

Бацитрацин А та тіроцидин.Синтез бацитрацину А Bacillus licheniformis також потребує наявності двох ферментних фракцій: АТФ та Mg²⁺. Одна з фракцій зв’язує L-орнітин та L-лізин, інша - L-ізолейцин, L-цистеїн, L-лейцин, L-глутамінову кислоту, L-фенілаланін, L-гістидин та L-аспаргін. Механізм синтезу практично не відрізняється від такого у граміцидина С. До складу ферментних фракцій також входить фосфопантотеїн, який утворює тіольний зв’язок з амінокислотою. Немає достатньої з’ясованості, на якому етапі синтезу утворюється тіазолідинове кільце по ходу елонгації молекули пептиду або після повного завершення синтезу. Зв’язок між β-карбоксильною групою аспарагінової кислоти та ε-аміногрупи лізину може виникати після утворення лінійного додекапептида

Модель, яка пояснює функцію граміцидин С- синтетази

Бацитрацин А

Тіроцидин А

Тіроцидин В – L-триптофан в положенні 3;

» С-L-триптофан в положенні 3 та D-триптофан в положенні 4;

» D-L-триптофан в положеннях 3 та 7 та D-триптофан в положенні 4.

Було висловлене припущення, що на синтез бацитрацину А негативно впливають деякі метаболіти катаболізму глюкози, тобто має місце катаболітна репресія. На відміну від граміцидину С та бацитрацину А для синтезу тироцидинів треба три різних ферменти. Однак механізм синтезу (ініціація, активація, рацемізація та елонгація) підлягає тим же закономірностям, основна з яких – утворення тіоефірного зв’язку з молекулою фосфопантотеїну.

Перший з названих ферментів (молекулярна маса 100000) здійснює активацію L-фенілаланіна та його ізомеризацію в D форму. Ця фракція взаємозамінна з фенілаланінрацемазою ферментної системи синтезу граміцидину С. Друга фракція (молекулярна маса 230000) містить в активованій формі L-пролін, який приймає D-фенілаланін, утворюючи дипептид D-фенілаланін L-пролін. Третя фракція (молекулярна маса 460000) активує останні 8 амінокислотних залишків у співвідношенні 1 моль кожної із амінокислот на 1 моль ферменту. Дипептид D-фен-L-про переноситься з другої фракції на третю, приєднуючись в залежності від типу синтезуючої молекули до D-фенілаланіну або до L-триптофану. Синтез проміжних пептидів відбувається, як і при синтезі граміцидину С, але на відміну від нього – на третій фракції ферментної системи синтезу.

Актиноміцини.Актиноміцини умовно можуть бути вінесені до групи речовин, які мають пептидний характер. Молекули актиноміцинів складаються з двох частин гетероциклічної та пептидної. Гетероциклічна частина у всіх актиноміцинів однакова, вона уявляє собою феноксазоновий хромофор. Різноманіття групи актиноміцинів обумовлене різними варіаціями в пептидній частині молекули. Це стосується як кількісних відношень, так і якісного складу. Характерною особливістю амінокислотного складу є наявність D-амінокислот, а також N-метилпохідних. Особливу увагу привертає сьогодні актиноміцин D. Механізм його дії полягає в зв’язуванні з ДНК, у результаті чого відбувається вибіркове порушення здатності ДНК слугувати матрицею для синтезу РНК.

Відносно механізму біосинтезу гетероциклічної частини актиноміцинів було виказане припущення про можливість реакції окисної конденсації двох однакових молекул о-амінофенолів, які містять пептидні групи. При конденсації двох однакових молекул таких попередників може виникнути лише одна речовина. Якщо в реакцію вступає два попередника, пептидні ланцюги яких різняться тільки на один амінокислотний залишок, можуть утворитися вже чотири різні речовини. Як відзначалося вище, актиноміцини різняться за складом або розташуванню амінокислот пептидного ланцюга. Склад та будова речовини, що утворилася залежить не тільки від специфічних особливостей організма-продуцента, але і від умов, в яких відбувається його культивування. На амінокислотний склад можуть впливати амінокислоти середовища. При внесенні в середовище амінокислот,які входять до складу пептида, найбільш сильний вплив оказує валін. В цьому випадку біосинтез оказується направленим у бік синтезу фракцій, що містять валін. Найбільш легкій заміні в пептидній частині молекули піддається місце, що займає валін та ізолейцин. У зв’язку з цим найбільший вплив на будову актиноміцинів оказують амінокислоти лей- цинової групи.

Формування пептидного ланцюга відбувається згідно вище написаним положенням. На якому етапі синтезу відбувається приєднання пептиду, не з’ясовано.

Контрольні питання:

1. Охарактеризувати низькомолекулярні пептиди і їх функції в клітинах

2. Розкрити особливості біосинтезу молекул низькомолекулярних пептидів

3. Навести особливості біосинтезу граміцидину С

4. Навести особливості біосинтезу бацитрацину А і тіроцидину

5. Навести особливості біосинтезу актиноміцинів

Поиск по сайту: