Використання біокаталізаторів для виробництва спирту

3.1. Виробництво спирту як палива. Традиційним біокаталізатором спиртового зброджування солодового і виноградного сусла, виноматеріалів, фруктових, овочевих та інших рослинних соків, цукрово-і крохмаловмісних матеріалів і т.д. з метою одержання спиртовмісних композицій, є вільні дріжджові клітини.

Необхідність у підвищенні технологічності процесу зброджування сприяло розробці нових біокаталізаторів, що забезпечують, зокрема, підвищення тривалості їх використання в ферментаційних процесах, спрощення стадії відділення біокаталізатора від ферментаційного середовища, можливість регенерації та повторного використання відпрацьованого біокаталізатора, поліпшення технологічності безперервних процесів спиртового зброджування.

Найбільш близьким до винаходу за сукупністю суттєвих ознак є спосіб одержання біокаталізатора спиртового бродіння, що застосовується для отримання етанолу (описаний в патенті DE 3432923), що характеризується наступною сукупністю суттєвих ознак.

Вільні дріжджові клітини суспендують у фізіологічному розчині і змішують з попередньо приготовленим стерильним водним розчином альгінату натрію. Отриману суспензію розчину альгінату натрію з клітинами дріжджів подають у вигляді крапель у ванну з розчином хлористого кальцію. При попаданні крапель у ванну в результаті обміну іонів Na+ на іони Са 2+ утворюються 3-х мм гелеподібні гранули (перлини). Виниклі внаслідок іонотропного утворення гелеві гранули витримують у розчині хлористого кальцію при постійному перемішуванні протягом 30 хв, відсівають і багаторазово промивають проточною водою. Потім промиті гранули протягом 15 хв при постійному перемішуванні ополіскують у розчині альгінату натрію. Завдяки дифузії іонів Са2+ з гелевих перлин у розчин альгінату натрію навколо гранул-перлин утворюється досить товста оболонка з Са-альгінату. Гранули знову промивають проточною водою і занурюють на 1 год в розчин хлористого кальцію, після витримки в розчині хлористого кальцію гранули знову піддають багаторазовому промиванню проточною водою. Отримані гранули біокаталізатора стерилізують опроміненням протягом 5 хв 6 Вт-лампою УФ.

Недоліком описаного відомого способу одержання біокаталізатора спиртового бродіння є складність його приготування в промисловому масштабі з отриманням з високими швидкостями і низькою собівартістю значної кількості біокаталізатора високої якості, зокрема, через його багатостадійність, а також складності запобігання агломерації гелевих частинок з включеними вільними дріжджовими клітинами, які утворюються на поверхні рідини, що містить зшиваючий агент (CaCl₂),.

Крім того, за відомим способом отримують біокаталізатор, частинки якого оточені «досить товстим шаром» гелю Са-альгінат. Даний шар забезпечує більш тривалий термін експлуатації каталізатора, ускладнюючи вихід дріжджових клітин з матриці гелевого носія, також ускладнюючи тим самим масоперенос між рідкою фазою поживного середовища і гелевою фазою каталізатора, що містить, власне, сам активний біокомпонент - дріжджові клітини, що істотно знижує активність біокаталізатора в цілому.

Завдання винаходу полягає в розробці більш простого у виконанні, технологічного способу одержання високоактивного біокаталізатора спиртового бродіння на основі вільних дріжджових клітин (іммобілізовані гранульовані дріжджі (далі - ІГД). Даний біокаталізатор володіє підвищеним терміном використання у промисловому виробництві етилового спирту як хімічного продукту, що використовуєтьтся в якості палива за рахунок виключення протікання агломерації гелевих частинок з включеними вільними дріжджовими клітинами.

Поставлена задача вирішується тим, що в способі отримання біокаталізатора спиртового бродіння, що включає накопичення біомаси дріжджів і її іммобілізацію включенням в гелеву матрицю шляхом змішування з розчином гелеутворюючого матеріалу з подальшим його затвердінням іонами Са 2+, згідно винаходу в якості гелеутворюючого матеріалу використовують суміш екзополісахариду з молекулярною масою, отриманого з штаму бактерій Paracoccus denitrificans МКПМ В-8617, і альгінату натрію в масовому співвідношенні 0,1-0,9:3,5-4,5.

Екзополісахарид, утворений залишками глюкози, галактози, манози, рамнози (відповідно 5:2:4:1), містить у своєму складі глюкуронову і піровиноградну кислоти, а також ацильні групи. Молекулярна маса екзополісахариду лежить в межах 0,5 × 106-2 × 107 Д.

Суть винаходу полягає в наступному.

Для накопичення біомаси культивування дріжджів, наприклад, Saccharomyces cerevisiae, здійснюють у ферментерах в умовах аерації. Результатом здійснення культивування дріжджів є отримання біомаси у вигляді суспензії вільних дріжджових клітин, використовуваної далі в способі отримання біокаталізатора спиртового бродіння.

Порошкоподібний альгінат натрію вводять в 0,1-0,9% (мас.) водний розчин екзополісахариду в кількості, що забезпечує отримання концентрації альгінату натрію в розчині полісахаридів 3,5-4,5% (мас). Отриманий розчин стерилізують шляхом його автоклавування протягом 18-22 хв при температурі 118-124 ° С, потім охолоджують до кімнатної температури.

Рівні об'єми отриманого стерильного розчину полісахаридів і суспензії вільних дріжджових клітин змішують. Отриману суспензію у вигляді крапель за допомогою насоса подають через відкалібрований капіляр діаметром від 0,5 до 5 мм з висоти 10-30 см (вертикально) в розчин агента, що зшиває - 2-2,5%-ний водний розчин хлористого кальцію, взятий у надлишку . В результаті взаємодії крапель суспензії розчину полісахаридів і вільних дріжджових клітин з розчином хлористого кальцію в результаті поверхневого обміну іонів натрію альгінату натрію та іонів кальцію з розчину зшиваючого агента утворюються гелеві гранули сферичної форми діаметром 1-4 мм (висота 10-30 см є оптимальною для утворення сферичних гранул). Утворені гелеві гранули витримують у розчині хлористого кальцію протягом 30-40 хв для остаточного їх затвердіння, після чого промивають стерильною водою.

Отримані пружні білі напівпрозорі сферичні гранули діаметром 1-4 мм і є біокаталізатором спиртового бродіння, які використовують у ферментаційному зброджуванні цукрів для одержання етилового спирту як хімічного продукту, використовуваного, зокрема, в якості палива.

Гранули біокаталізатора включають в свій склад гелеву матрицю, що складається з суміші екзополісахариду і Na-Са-альгінату, і іммобілізовані гелевою матрицею вільні дріжджові клітини.

Даний біокаталізатор проявляє високу бродильну активність в тривалих бродильних процесах і високу конверсію цукрів. Даний біокаталізатор успішно може бути використаний як у періодичних, так і в безперервних ферментаційних процесах.

Випробування показали, що біокаталізатор щодо винаходу протягом піврічного використання в процесах спиртового зброджування для отримання етанолу як хімічного продукту, застосовуваного в якості палива, не зазнав істотних змін не тільки у своїх біокаталітичних властивостях, але і в механічних характеристиках.

3.2. Виробництво медичного спирту. Відомий широкий ряд запатентованих технічних рішень [наприклад, JP 57-150385, JP 60153794, JP 1067189, US 5079011, US 5334229, DE 3432923, FR 2320349, FR 2359202, FR 2601687, FR 2600673, FR 2586256, ЕР 388588, FR 2668081, ES 2192986], що включають в свій склад способи одержання біокаталізаторів спиртового бродіння на основі дріжджів, частково вирішують проблеми, які виникають при використанні вільних дріжджових клітин при виробництві вин, пива, шипучих напоїв з різним вмістом алкоголю, а також шампанізації виноматеріалу.

Загальною істотною ознакою цих відомих способів є іммобілізація методом включення вільних дріжджових клітин в матрицю гелевого носія з утворенням твердих, як правило, сферичних частинок, причому затвердіння вихідного гелеутворюючого матеріалу (наприклад, натрієвих або калієвих солей альгінової кислоти) здійснюють або методом іонного обміну з використанням іонів двовалентних або тривалентних металів (хлористі кальцій, барій, стронцій, алюміній), або полімеризацією включеного у вихідну дріжджову суспензію мономеру, наприклад акриламіду, або специфічною обробкою вихідної дріжджової суспензії, що включає в свій склад полімер, наприклад полівініловий спирт, з утворенням, так званих, кріогелей.

Іноді використовують матрицю на основі соняшникового лушпиння для процесу іммобілізації дріжджів роду Saccharomyces cerevisiae. Нативне соняшникове лушпиння має високу механічну міцність, тому для збільшення питомої поверхні, реакційної здатності його подрібнюють до фракцій 1-0,5 мкм.

У ході дослідження був проведений порівняльний аналіз іммобілізованих мікробних клітин на активованому вугіллі та модифікованому соняшниковому лушпинні за методикою Швець В.М. Дослідження показали, що носії володіють різною здатністю утримувати дріжджові клітини роду Saccharomyces cerevisiae: на активованому вугіллі закріплюється 59,6% дріжджів, на модифікованому соняшниковому лушпинні – 95,3%. Ці відмінності пояснюються особливостями кристалічної структури носіїв і за рахунок адсорбції клітин Saccharomyces cerevisiae на поверхні модифікованої соняшникового лушпиння відбувається також їх вміст у міжволоконному проміжку.

В результаті проведення експерименту встановлено, що процес спиртового бродіння йде інтенсивніше в дослідах з модифікованим соняшниковим лушпинням: вміст спирту в бражці, одержаній з використанням лушпиння становить 10,2 % (об.), на активованому вугіллі - 5,7 % (об.). У дослідах з багаторазовим використанням іммобілізованих дріжджів роду Saccharomyces cerevisiae для процесу бродіння спирту на модифікованому соняшниковому лушпинні в лабораторних умовах встановлено можливість використання без зниження бродильної активності протягом 8-10 діб. Відпрацьований екологічний носій соняшникове лушпиння із залишками дріжджів, після бродіння, може бути використаний в якості кормової добавки у тваринництві.

4. Біокаталізотор для одержання глюкозо-фруктозних сиропів.

Відомо, що солодкі сиропи – глюкозно-фруктозний, інвертний та інші, широко застосовуються в харчовій промисловості в якості натуральних замінників цукру білого при виробництві безалкогольних напоїв, кондитерських виробів і продуктів дієтичного харчування, а також при консервуванні. Використання цих сиропів в рецептурах приготування різних виробів суттєво покращує їх споживчі властивості, уповільнює процеси висихання і затвердіння (черствіння).

Отримання глюкозо-фруктозний сиропів, важливий з точки зору дієтології процес, вперше був реалізований в промисловості в 1973 р. американською компанією «Клінтон Корн». В даний час це найбільший промисловий процес на основі іммобілізованих ферментів.

Фруктоза порівняно з глюкозою, володіючи більш приємним смаком, на 60-70% солодша, тобто її споживається менше звичайного цукру, крім того, метаболізм фруктози в організмі людини не пов'язаний з перетворенням інсуліну, вона менш шкідлива для зубів і т.д. Технології отримання глюкозо-фруктозних сиропів за короткий термін були розроблені і освоєні в промислових масштабах багатьма західними країнами. У 1980 р. їх випуск склав 3.7 млн. тонн. Продукт з товарною назвою «ізоглюкоза» надходить на ринок у вигляді сиропів, із використанням рідкої хроматографії вміст фруктози може бути підвищено до 90%.

Біохімічна сутність процесу зводиться до перетворення (ізомеризаціі) глюкози (попередньо отриманої в результаті гідролізу кукурудзяного або картопляного крохмалю) у фруктозу під впливом іммобілізованої глюкозоізомерази. Реакція протікає в одну стадію до тих пір, поки в реакційній суміші співвідношення глюкози і фруктози практично не зрівняється. Кінцевим продуктом може бути даний розчин; фруктоза може бути відокремлена з розчину, а глюкоза – піддається подальшій ізомеризації.

Процес протікає безперервно в реакційних колонах висотою 5 м, заповнених шаром каталізатора – іммобілізованого ферменту у вигляді полімерних гранул, порожнистих волокон, кусочків гелю і т.д. Час напівінактивації ферменту становить від 20 до 50 діб, тобто замінювати або обновляти каталізатор доводиться раз у 2-3 місяця. Продуктивність біореакторів варіює від 1 до 9 т глюкозо-фруктозного сиропу на 1 кг іммобілізованого ферменту. За економічними оцінками, виконаним в Угорщині на основі аналізу виробництва глюкозо-фруктозного сиропу потужністю 120 тис. т кукурудзяного зерна в рік, виробництво такого типу економічніше в 1,5 рази порівняно з традиційним отриманням цукру з цукрового буряка.

Корпорацією «Цетус» (США) розроблено новий процес отримання 100% фруктози з глюкозних сиропів. На першому етапі глюкоза під дією іммобілізованої піранозо-2-оксидази окислюється в D-глюкозон, який на другому, хімічному, етапі на паладієвому каталізаторі практично з 100% виходом відновлюється до фруктози.

Удосконалення складу біокаталізаторів та розробка нових способів іммобілізації є актуальним завданням.

Відомий спосіб іммобілізації клітин актиноміцетів Streptomyces albogriseolus 28-3, що володіють глюкозоізомеразною активністю і каталізують ферментативну реакцію ізомеризації глюкози у фруктозу, шляхом включення біомаси в нерозчинний носій.

Для цього біомасу Streptomyces albogriseolus 28-3 змішують з розчином хітозану. В отриману суспензію спочатку додають розчин солі тривалентного ацетату кобальту Co (III), який отримують окисленням двовалентного кобальту Со (II) перекисом водню. Потім в отриману суміш вводять по краплях водний розчин аміаку для формування гранул біокаталізатора. Активність біокаталізатора складає 190 мкмоль / хв / г вологого біокаталізатора при 60 °С. При іммобілізації бактеріальні клітини зберігають не більше 66 % від вихідної активності в суспензії. Недоліками даного способу є наступні:

1) до складу біокаталізатора входить кобальт в нестійкому трехвалентному стані,

2) при приготуванні біокаталізатора використовують агресивні (перекис водню) і реагенти з сильним запахом (аміак).

Відомий спосіб іммобілізації глюкозоізомерази шляхом адсорбції на сополімерах стиролу і дивінілбензолу, активованому хлорметилюванням і обробленим триалкілфосфіном і гідроксидом лужного металу. Тривалість стадії приготування носія і адсорбції становлять 19 год і 5 год, відповідно. При іммобілізації глюкозоізомераза зберігає не більше 69 % від вихідної активності ферменту в розчині. Біокаталізатори втрачають 30-50 % початкової активності свіжоприготовленого каталізатора через 31 добу експлуатації при 60 °С. Максимальна продуктивність складає 1,04 кг сухих речовин глюкозо-фруктозного сиропу з 1 г біокаталізатора.

Недоліками даного способу є використання органічних полімерів, токсичних органічних сполук, агресивних реагентів (луг), а також багатостадійність процесу іммобілізації (активація, обробка носія, адсорбція ферменту) і його велика тривалість.

Найбільш близьким є спосіб іммобілізації частково очищеного препарату глюкозоізомерази з Actinomyces olivocinereus 154 на макропористих носіях на основі висушених і пропечених форм діоксиду кремнію (силікагелю і силохромах) шляхом ковалентного зв'язування за допомогою амінопропілтриетоксисилану і глутарового діальдегіду. Тривалість стадій приготування носія та іммобілізації на ньому ферменту складають не менше 2 год і 6 год, відповідно. Слід зазначити, що поверхня висушених і пропечений форм діоксиду кремнію з уже сформованою текстурою носія є досить інертною, і для іммобілізації ферментів потрібна додаткова активація поверхні-амінопропілтриетоксисиланом, за допомогою якого на поверхню вводяться аміногрупи, а також використання біфункціональних зшиваючих реагентів таких як глутаровий діальдегід. При іммобілізації глюкозоізомераза зберігає 10-40 % від вихідної активності ферменту в розчині. Біокаталізатор на основі іммобілізованої глюкозоізомерази зберігає 75% початкової активності свіжоприготовленого зразка через 40 год роботи при 70 °С.

Суттєвими недоліками даного способу є наступні:

1) використання токсичних зшиваючих реагентів (глутарового діальдегіду), що призводять до втрати ферментативної активності,

2) низька ферментативна активність біокаталізатору, складова 5,3 мкмоль / хв / г біокаталізатору при 60 °С;

3) втрата при іммобілізації 60-90 % від вихідної активності ферменту в розчині,

4) застосування для приготування біокаталізатору очищеного ферменту, що призводить до істотного подорожчання ферментного препарату з глюкозоізомеразною активністю через наявність стадій виділення та очищення,

5) порівняно велика тривалість процесу іммобілізації (не менше 8 год).

Завдання вирішується використанням біокаталізатору – іммобілізованих бактеріальних клітин, що володіють глюкозоізомеразною активністю (БКГІА), в процесі ізомеризації глюкози або фруктози. Біокаталізатор містить біомасу, діоксид кремнію, використовуваний у вигляді гідрогелю; при цьому співвідношення основних компонентів біокаталізатору – біомаси бактеріальних клітин і діоксиду кремнію, становить від 1:6 до 1:10 у вагових частинах за сухими речовинами. Біокаталізатор додатково містить сполуки магнію і двовалентного кобальту, які використовуються для активації і стабілізації внутрішньоклітинного ферменту глюкозоізомерази. В якості БКГІА використовують біомасу бактерій у вигляді пасти з вологістю 75-80%.

Завдання вирішується також способом приготування біокаталізатора для отримання глюкозо-фруктозного сиропу, за яким іммобілізацію бактеріальних клітин з глюкозоізомеразною активністю в діоксид кремнію проводять шляхом змішування біомаси бактеріальних клітин у вигляді вологої пасти, діоксиду кремнію у вигляді гідрогелю, та солей магнію і двовалентного кобальту у вигляді водних розчинів солей (сульфатів, або нітратів, або хлоридів), з наступним висушуванням одержаної суміші на повітрі при температурі 50-70 °С протягом не більше 2 год, пресуванням і грануляцією в частинки розміром 0,4-3,0 мм.

Завдання вирішується також способом отримання глюкозо-фруктозного сиропу в процесі ізомеризації глюкози або фруктози, в якому використовують описаний вище біокаталізатор. Процес проводять в реакторі з нерухомим шаром при температурі 60-70 °С і при швидкості потоку реакційного середовища, що містить глюкозу або фруктозу, через шар біокаталізатору. Біокаталізатор використовують у вигляді частинок розміром 0,4-3,0 мм.

Технічний результат досягається внаслідок реалізації наступних груп відмінних ознак:

1) оптимізацією складу біокаталізатора,

2) методом приготування біокаталізатору шляхом змішування біомаси БКГІА з діоксидом кремнію у вигляді гідрогелю, а не у вигляді висушеного і прожарену діоксиду кремнію (силікагелю),

3) методом отримання гідрогелю діоксиду кремнію, що забезпечує набір заявлених властивостей,

4) певним набором властивостей гідрогелю діоксиду кремнію і готового біокаталізатора з глюкозоізомеразною активністю,

5) методом проведення каталітичної реакції ізомеризації моносахаридів (глюкози або фруктози).

Слід зазначити, що використання діоксиду кремнію у вигляді гідрогелю, а не силікагелю, призводить до рівномірного розподілу всіх компонентів в обємі біокаталізатора, забезпечує міцне закріплення і відсутність вимивання БКГІА. Метод приготування біокаталізатору відрізняється меншою, порівняно з прототипом, кількістю стадій, а також порівняльною простотою і доступністю всіх компонентів біокаталізатора.

Біокаталізатор для ізомеризації глюкози має наступний склад по основних компонентах: бактеріальні клітини, що володіють глюкозоізомеразною активністю (БКГІА),і діоксид кремнію у вигляді гідрогелю. Гідрогель діоксиду кремнію отримують шляхом взаємодії силікату натрію або калію з мінеральною кислотою, з подальшим відмиванням і фільтрацією гідрогелю.

Біокаталізатор ізомеризації глюкози готують шляхом ретельного змішування БКГІА, гідрогелю діоксиду кремнію і розчинних солей Mg (II) та Со (II) до однорідної маси. Потім отриману суміш висушують. Висушену суміш пресують при тиску і механічно подрібнюють. У результаті отримують гранульований твердий біокаталізатор, що володіє глюкозоізомеразною активністю.

Склад, спосіб приготування і властивості використовуваного гідрогелю діоксиду кремнію забезпечують високу активність і стабільність біокаталізатору. Так, при іммобілізації запропонованим способом зберігається більше 70 % від вихідної активності клітин в суспензії (в прототипі - 10-40 %). Тривалість процесу іммобілізації та приготування біокаталізатору для ізомеризації глюкози не перевищує 4 год (в прототипі - більше 8 год).

Набір властивостей біокаталізатору (склад, спосіб приготування, ферментативна активність) забезпечують високу ефективність роботи даного біокаталізатору в реакції ізомеризації глюкози або фруктози в глюкозо-фруктозні сиропи в проточних реакторах різного типу, в тому числі з нерухомим шаром біокаталізатору.

5. Застосування іммобілізованих клітин при очищені молока.

Нітрати потрапляють в молоко через кров тварин з кормами і водою. Вони викликають гіпоксію тканин, зміни в структурі і властивостях гемоглобіну. Особливо помітно позначається присутність нітратів на дитячий організм, знижуючи імунний захист. Потрапляння нітратів в організм людини особливо небезпечне через їх трансформації в нітрити за рахунок мікрофлори кишечника і тканинних ферментів.

У природі існує група денітрифікуючих мікроорганізмів, які здійснюють мікробіологічний процес відновлення нітратів до газоподібних азотистих продуктів, зазвичай до вільного азоту. Використання мікроорганізмів цієї групи для зниження вмісту нітратів у молоці можливо в тому випадку, якщо вони при розвитку не утворюють токсичних метаболітів, не змінюють смакових показників. Крім того, ці мікроорганізми повинні проявляти біохімічну активність в анаеробних умовах за низьких температур (не вище 10 °С), в слабокислому середовищі, повністю гинути при відомих режимах пастеризації. Цим вимогам відповідає штам Paracoccus denitrificans ВКМ У-1324, депонований у Всеросійській колекції мікроорганізмів. Це грамнегативні кокковидні мікроорганізми, факультативні анаероби. У безкисневому середовищі в присутності органічних субстратів (глюкози, молочної та піровиноградної кислот) при анаеробному диханні Paracoccus при рН близьких до 7,0 відновлюють нітрати до молекулярного азоту.

У молоці, що надходить на підприємство, визначають масову частку нітратів. Молоко резервують, при необхідності гомогенізують і охолоджують до 4-6 °С. Гомогенізація молока перешкоджає відстоюванню жиру при витримці. Визначають кількість активованої добової культури Paracoccus, що вноситься, і тривалість витримки. Молоко після внесення культури перемішують протягом 3-5 хв. при мінімальному числі обертів мішалки, потім суміш без перемішування витримують протягом розрахованого періоду для підтримки анаеробних умов. По закінченню процесу денітрифікації молоко пастеризують при 85 °С з витримкою 2 с. (або при 72 °С з витримкою 20 с.). Такий режим теплової обробки забезпечує 100% загибель клітин внесеної культури.

Іммобілізацію мікроорганізмів-денітрифікаторів пропонується здійснювати шляхом адсорбції їх на цеолітах. Іммобілізовані клітини упаковують в скляну колону. Молоко проходить через шар зверху. Випробування на пілотній установці показали високу ефективність процесу в разі обробки знежиреного молока. У безперервному проточному режимі молоко прокачується через біореактор з нерухомим шаром. При високому вмісті нітратів передбачається рециркуляція молока або проходження його через серію реакторів з нерухомим шаром.

Основні характеристики: пропонована технологія відрізняється безпекою, малими витратами, простотою у виконанні. Не потрібно спеціального устаткування. Продукт залишається без зміни смаку і запаху, не змінюються складові продукту.

Стадія розробки: продаж ліцензії, розроблено регламент напівпромислового застосування.

Поиск по сайту: