Молекулярно-генетичний метод

Даний метод є найбільш достовірним методом дослідження спадкових захворювань. Перевага ДНК-діагностики у порівнянні із іншими методами молекулярної генетики людини у тому, що цей метод дозволяє виявити та дослідити саме першопричину захворювання (ген, його локалізація, тип ушкоджень). Цей метод дозволяє виявити навіть мінімальні порушення первинної структури ДНК (в тому числі однонуклеотидні заміни), які неможливо дослідити іншими методами. ДНК-діагностика є малоінвазивною процедурою (достатньо 1-2 мл крові, букального епітелію, або декількох клітин матеріалу плоду, взятого в першому триместрі вагітності). Крім того подібний аналіз у разі виявлення мутації не потребує повторення, достатньо одного дослідження за життя пацієнта та навіть після його смерті.

Цей метод потребує обов’язкової першої стадії – отримання зразку ДНК. Наступний аналіз проводиться в залежності від поставлених задач дослідження.

Основними методами ДНК-діагностики в даній роботі були: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), фрагментний аналіз продуктів ПЛР із використанням різних видів гель-електрофорезів ДНК, визначення нуклеотидної послідовності ДНК за допомогою секвенування, ПЛР в реальному часі.

Полімеразна ланцюгова реакція.

ПЛР – багаторазове копіювання (ампліфікація) певного фрагменту ДНК із допомогою ДНК-полімерази та специфічних олігонуклеотидних ДНК-затравок (праймерів), які є гомологічними кінцям потрібної ділянки ДНК. Цикл ПЛР складається із трьох стадій: денатурації ДНК 2 одноланцюгові молекули; відпалювання – приєднання праймерів до ДНК-матриці; елонгації – добудови другого ланцюгу ДНК у межах праймерних послідовностей. В результаті багаторазового повторювання циклів ампліфікується потрібний фрагмент ДНК у кількості, яку можна спостерігати та аналізувати після електрофорезу.

Аналіз ПЛР-фрагментів ДНК.

Фрагменти ДНК, які були синтезовані в ході ПЛР (копії досліджуваних ділянок ДНК), знаходяться у ампліфікаційній суміші у кількості, яка є доступною для якісної оцінки та аналізу нуклеотидного складу. Оскільки фрагменти ДНК є від’ємно зарядженими молекулами, для їх подальшого анлізу ампліфікаційні продукти фракціонують за їх довжиною (звичайний фрагментний аналіз), або конформацією просторових структур (при DGGE- та SSCP-аналізі) із використанням різних видів електрофорезів. На електрофореграмі частіше за все візуалізують смуги (зони локалізації фрагментів одного розміру або конформації) із допомогою флуоресцентного барвника броміду етидія та реєструють фотографічно в УФ-світлі.

Крім того реєстрація фрагментів ПЛР може відбуватися автоматично за допомогою різних типів аналізаторів флюоресценції (флюориметрів). Для цього необхідно мати ПЛР продукти, які є мічені флуоресцентним барвником із певними спектральними характеристиками, які є вівповідними типу лазерного детектора апиладу. В нашій работі використовувався фрагментний аналіз в горизонтальному агарозному гелі, в неденатуруючому поліакриламідному гелі, в денатуруючому градієнтному (DGGE-гель) та неградієнтному поліакриламідному гелі.

DGGE-аналіз.

Денатуруючий градієнтний гель-електрофорез (DGGE) дозволяє проводити детекцію будь-якої заміни в ланцюгу ДНК (в т.ч. однонуклеотидної), яка утворює легкоплавкий домен. За результатами аналізу розрахунку профілів плавлення доменів для 35 т.п.н. ДНК людини встановлено, що до 50-70% усіх замін пар основ підлягає виявленню (Lerman L.S. et all, 1986). Згідно із методикою DGGE молекули ДНК знаходяться при температурі початку денатурації при якій підлягають електрофоретичному розділенню у ПАА гелі, який містить зростаючий градієнт концентрацій сечовини та формаміду. Фрагменти ДНК, просуваючись гелем, наприкінець потрапляють в таку концентрацію денатурантів, при якій легкоплавкі домени стають нестабільними та швидко плавляться, в результаті чого утворюється частково дисоційована та частково двох ланцюгова структура. Такі молекули просуваються гелем повільніше, або взагалі застрягають. Положення в гелі, при якому рух молекули ускладнюється є унікальним та характеризує кожний певний фрагмент послідовності ДНК. Таким чином, молекули, які відрізняються замінами у легкоплавкому домені можуть бути розділені в такому гелі завдяки різниці в температурі плавлення домену. Описаний метод є скринуючим, оскільки він дозволяє виявити певну ділянку гену, у якій відбулася мутація, проте не дозволяє точно ідентифікувати виявлену мутацію. Для ідентифікації мутації проводять секвенування ділянки гену у якій був зареєстрований змінений електрофоретичний профіль.

ПЛР в реальному часі.

ПЛР в реальному часі (або кількісна ПЛР) – це лабораторний метод, основою якого є ПЛР. Даний метод використовується для одночасної ампліфікації та вимірювання кількості заданої молекули ДНК. Оскільки кинетика накопичення продуктів ампліфікації пов’язана із вихідною кількістю матриці, це дає можливість точно оцінити її кількість (на відміну від фрагментного аналізу звичайної ПЛР, ври якому оцінюємо якісні показники). В результаті вимірювань змін флюоресценції, які в автоматичному режимі відбуваються в реальному часі під час ампліфікації, визначається кількість копій досліджуваної ділянки безпосередньо, або опосередковано відносно внесеній стандартній кількості ДНК чи додаткових калібрувальних генів. За допомогою ПЛР в реальному часі можна також визначати специфічні однонуклеотидні заміни (SNPs). ПЛР в реальному часі не потребує стадії електрофорезу, дозволяє провести повний аналіз проби впродовж 60-120 хвилин та теоретично дозволяє детектувати навіть одну молекулу ДНК або РНК в пробі. Для постановки ПЛР в реальному часі потрібен спеціальний ампліфікатор із можливістю збуджувати та реєструвати флуоресценцію, яка відображує накопичення ампліконів, на кожному циклі ампліфікації.

Для кількісного аналізу використовують два підходи — використання флюоресцентних барвників, які інтеркалюють у дволанцюгові молекули ДНК в процесі ПЛР, та модифікованих дезоксинуклеотидів, які випромінюють світло післягібридизації із комплементарними ділянками ДНК. Спосіб детекції із використанням SYBR Green I базується на тому, що флюоресценція даного барвника значно зростає при його інтеркаляції у дволанцюгові молекули ДНК, що дозволяє спостерігати накопичення продуктів ампліфікації .

ОСНОВИ ГЕНЕТИКИ ЛЮДИНИ
Генетика людини вивчає явища спад­ковості і мінливості у популяціях лю­дей, особливості успадкування нор­мальних і патологічних ознак, залеж­ність захворювання від генетичної схильності і факторів середовища. Зав­данням медичної генетики є виявлення і профілактика спадкових хвороб.
Генетика людини — одна з найваж­ливіших проблем теоретичних основ су­часної медицини. Академік 1. П. Пав-лов, визнаючи важливе значення ге­нетики для фізіології і медицини, пи­сав: «Наші лікарі повинні як азбуку знати закони спадковості... Втілення у життя наукової істини про закони спад­ковості допоможе позбавити людство від багатьох скорбот і горя».
Одним з основоположників медичної генетики є видатний радянський нев­ропатолог С. М. Давиденков (1880— 1961), який розпочав свою плідну роботу у двадцятих роках на Україні. Він вперше застосував ідеї генетики у клі­ніці, дав аналіз ряду спадкових хво­роб, частина з яких була описана ним також вперше. Важливою заслугою С. М. Давиденкова є розроблення методів медико-генетичного консуль­тування і його практичне застосу­вання.
Особливості генетики людини. До­слідження генетики людини пов'язане з великими труднощами, причини — у неможливості експериментального схрещування, повільній зміні поколінь, малій кількості потомків у кожній сі­м'ї. Крім того, на відміну від класич­них об'єктів, що вивчаються у загаль­ній генетиці, у людини складний каріо­тип, велика кількість груп зчеплення. Проте, не зважаючи на всі ці трудно­щі, генетика людини успішно розвивається.
Неможливість експериментального схрещування компенсується тим, що дослідник, спостерігаючи широку людську популяцію, може вибирати із тисяч шлюбних пар ті, які необхідні для генетичного аналізу. Метод гібри­дизації соматичних клітин дозволяє експериментальне вивчати локалізацію генів у хромосомах, проводити аналіз груп зчеплення (див. нижче).
При вивченні генетики людини ви­користовуються такі методи: генеало­гічний, близнюковий, популяційно-ста­тистичний, дерматогліфичний, біохіміч­ний, цитогенетичний, гібридизації со­матичних клітин і метод моделювання.
У людини встановлені всі 24 теоре­тично можливі групи зчеплення генів: із них 22 локалізовані у аутосомах, у кожній із яких міститься по кілька сот генів. Більше 100 генів локалізовано у статевих хромосомах.
У ссавців, у тому числі і в людини, Х- і Y-хромосоми мають гомологічну ділянку, в якій відбувається їх синапсис і можливий кросинговер. Всі гени, які локалізовані у статевих хромосо­мах людини, можна поділити на три групи залежно від того, у яких ділян­ках статевих хромосом вони знаходять­ся.
Перша група охоплює гени, які локалізовані у тій частині X-хромосо­ми, що не має гомологічної ділянки у У-хромосомі. Вони повністю зчеплені зі статтю, передаються виключно через X-хромосому. До їх числа відносяться рецесивні гени гемофілії, дальтонізму, атрофії зорового нерва тощо. Домі­нантні гени із цієї ділянки однаково проявляються в осіб обох статей, ре­цесивні — у жінок тільки у гомозигот­ному, а у чоловіків — і гемізиготному стані.
Другу групу складає невелика кількість генів, які розташовані у не­парній ділянці Y-хромосоми. Вони мо­жуть зустрічатися тільки у осіб чолові­чої статі і передаються від батька до сина. До них відносяться: волосатість вух, іхтіоз (шкіра у вигляді луски ри­би), перетинки між пальцями на но­гах.
Третя група— гени, які розта­шовані у парному сегменті статевих хромосом, тобто гомологічному для Х- і Y-хромосом. їх називають непов­но або частково зчепленими зі статтю. Вони можуть передаватися як з Х-, так і з Y-хромосомою і переходити з однієї до іншої у результаті кросинго-вера.
Методи вивчення спадковості у лю­дини. Генеалогічний метод грунтується на простеженні якої-небудь ознаки у ряді поколінь з вказівкою родинних зв'язків між членами родоводу. Генеа­логія, у широкому розумінні слова,— родовід людини.
Генеалогічний метод був введений у науку в кінці XIX ст. Ф. Гальтоном. Суть його полягає у тому, щоб з'ясу­вати родинні зв'язки і прослідкувати наявність нормальної або патологічної ознаки серед близьких і далеких роди­чів у даній сім'ї.
Збирання даних починається з пробанда — особи, родовід якої необхідно скласти. Ним може бути хвора або здо­рова людина — носій якої-небудь озна­ки або особа, яка звернулась за пора­дою до лікаря-генетика. Брати і сестри пробанда називаються сибсами. Зви­чайно родовід складається за однією або кількома ознаками. Метод вклю­чає два етапи: збір відомостей про сі­м'ю і генеалогічний аналіз. Складання родоводу порівняно проста справа, про­те при уявній доступності і простоті цей метод потребує великої ретельнос­ті, вміння вірно ставити запитання, ви­сокої кваліфікації лікаря. Генеалогіч­ний метод є основною зв'язуючою лан­кою між теоретичною генетикою люди­ни і застосуванням її досягнень у ме­дичній практиці.
Хоч генеалогічний метод є одним із найдавніших, його можливості вико­ристовуються не у повну міру через те, що широко використовуються нові, більш досконалі методи аналізу фено­типу, виявлення гетерозиготних носіїв, обліку впливу факторів середовища тощо.
Для складання родоводу проводять короткі записи про кожного члена ро­доводу з точною вказівкою його спо­рідненості у відношенні до пробан­да. Потім роблять графічні зображен­ня родоводу; для складання схеми прийняті стандартні символи.
При складанні родоводу покоління можна позначати римськими цифрами зверху вниз (зліва від родоводу). Потомство одного покоління (сибси) роз­ташовується в одному горизонтально­му ряду у порядку народження (зліва направо). У межах одного покоління кожний член позначається арабськими цифрами, у тому числі чоловіки і жін­ки сибсів. Кожний член родоводу мо­же бути позначений відповідним шиф­ром, наприклад II—5, III—7.
Генеалогічний метод тим інформативніший, чим більше є достовірних відомостей про здоров'я родичів хво­рого. При збиранні генетичних відомос­тей і їх аналізі необхідно мати на ува­зі, що ознака може проявитися у різній мірі, іноді незначній (так звані мікро­ознаки). Мікропроявом природженого вивиху стегна може вважатися спло­щення вертлужної западини і збіль­шення рухливості («розхитаність») та­зостегнових суглобів. У родичів людей із спадково зумовленими дефектами губи і піднебіння частіше,, ніж у конт­ролі, зустрічаються високе вкорочене піднебіння, борозна на язичку, анома­лії прикусу, сплощення носа або роз­двоєння його кінчика.
Після складання родоводу почина­ється другий етап — генеалогічний ана­ліз, метою якого є встановлення гене­тичних закономірностей. Спочатку не­обхідно встановити, чи носить ознака спадковий характер. Якщо яка-небудь ознака зустрічалася у родоводі кілька разів, то можна думати про її спадко­ву природу. Проте це може бути і не так. Наприклад, якісь зовнішні факто­ри або умови професії можуть викли­кати подібні захворювання у членів сім'ї. Вплив шкідливих факторів на жінку під час вагітності може призвес­ти до народження дітей з подібними вадами.

У випадку виявлення спадкового ха­рактеру ознаки необхідно встановити тип успадкування: домінантний, реце­сивний, зчеплений зі статтю (мал. 5.3).
Основні ознаки аутосомно-домінантного успадкування такі: прояв ознаки у рівній мірі у представників обох ста­тей; наявність хворих у всіх поколін­нях (по вертикалі) і при відносно ве­ликій кількості сибсів і по горизонталі (у сестер і братів пробанда). У гетеро­зиготного батька імовірність народ­ження хворої дитини (якщо другий з батьків здоровий) складає 50 %. Не­обхідно врахувати, що і при домінант­ному типі успадкування може бути пропуск у поколіннях за рахунок сла­бого прояву, «стертих» форм захворю­вання (мала експресивність мутантно­го гена) або за рахунок його низької пенетрантності (коли у носія даного гена ознака відсутня). Можливо у деяких випадках мутантний ген пригні­чується якимось епістатичним геном. Необхідно врахувати, що при деяких домінантне успадковуваних захворю­ваннях людина може захворіти після 40—50 років. У випадку смерті у більш ранньому віці ніяких даних про мож­ливу хворобу цього члена сім'ї, при­родно, немає, але є імовірність захво­рювання у нащадків.
Основні ознаки аутосомно-рецеси-ного успадкування: відносно невелика кількість хворих у родоводі, наявність хвороб «по горизонталі» (хворіють сибси - рідні, двоюрідні). Батьки хво­рої дитини частіше фенотипово здоро­ві, але є гетерозиготними носіями ре­цесивного гена. Імовірність народжен­ня хворої дитини складає 25%. При прояві рецесивних захворювань часто зустрічається кровна спорідненість батьків хворого.
Необхідно мати на увазі, що наявність віддаленої спорід­неності буває невідомою членам сім'ї. Приходиться враховувати побічні мір­кування, наприклад, походження із одного і того ж малонаселеного пунк­ту або належність до якої-небудь ізольованої етнічної або соціальної групи.
Яскравий приклад прояву патологіч­ної рецесивної ознаки при споріднено­му шлюбі показаний на мал. Із цього родоводу видно, що у шлюб всту­пили сибси четвертого ступеня спорід­неності. Від двох споріднених шлюбів народилося у одній сім'ї четверо, а у іншій — двоє дітей з тяжкою спадко­вою хворобою — ідіотією Тея—Сакса. (Причина цієї хвороби — нагромад­ження ліпідів у нервових клітинах мозку і їх руйнування). Мабуть, всі чоти­риюрідні сибси були гетерозиготними носіями цього рецесивного гена, який вони отримали від спільного предка.
Рецесивна ознака проявляється то­ді, коли у генотипі є обидва рецесивні алеля. Крім описаного варіанта, коли батьки мають генотипи Аа і Аа, мож­ливі і інші варіанти вихідних геноти­пів. Обидва батьки — рецесивні гомо­зиготи; у цьому випадку (безумовно, рідкісному) всі діти будуть хворими. Один із батьків хворий, а інший — здо­ровий, але має у генотипі мутантниП ген у гетерозиготному стані (аа і Аа). У цьому випадку спостерігається симу­ляція домінантного успадкування (тео­ретично можливе розщеплення 1:1). Проте найчастіше спостерігаються ва­ріанти народження хворої дитини у фе-нотипово нормальних батьків і наяв­ність хворих у бічних лініях родоводу.
Захворювання, які зумовлюються зчепленим зі статтю геном (локалізо­ваним у X-хромосомі), можуть бути як домінантними, так і рецесивними. При домінантному X-зчепленому успадку­ванні захворювання однаково прояв­ляється як у чоловіків, так і у жінок і згодом може передаватися нащадкам. У цьому випадку жінка може переда­вати цей ген половині дочок і полови­ні синів (її генотип — ХAХa, імовір­ність передавання X-хромосоми з до­мінантним мутантним геном—50%). Чоловіки ж передають цей ген з X-хро­мосомою всім дочкам. Зрозуміло, що сини, які мають у своєму генотипі тіль­ки одну материнську Х-хромосому, цей ген від батька успадкувати не мо­жуть. Прикладом такого захворюван­ня є особлива форма рахіту, стійкого до лікування кальциферолами (віт.D).
При рецесивному успадкуванні хво­роб, які зчеплені з X-хромосомою, як правило, страждають чоловіки. Гете­розиготна мати (носій) передає му­тантний ген половині синів (які будуть хворими) і половині дочок, які, зали­шаючись фенотипово здоровими, як і мати, також є носіями і передають ре­цесивний ген разом з X-хромосомою наступному поколінню.
Прикладом такої хвороби є кольорова сліпота (даль­тонізм), гемофілія. У рідких випадках ці ознаки можуть проявитися і у жі­нок, якщо їхній батько був хворим, а мати була гетерозиготна.
Близнюковий метод — один з найбільш ранніх методів вивчення генети­ки людини, але він не втратив свого значення і сьогодні. Близнюковий ме­тод дослідження був запропонований у 1876 р. англійським антропологом і психологм Ф. Гальтоном. Він виділив серед близнят дві групи: однояйцеві (монозиготні) і двояйцеві (дизиготні). На сьогодні в середньому на кожні 100 пологів приходиться одне народження близнят. Демографи розрахували, що на Землі проживає близько 50 млн пар близнят. Приблизно одну третину всіх близнят складають однояйцеві, а дві третини — двояйцеві. Кількість моно-зиготних близнят у різних регіонах земної кулі величина відносно постій­на, з невеликими коливаннями. На­приклад. в Італії 0,37%, в Данії— 0,38, в Японії — 0,40, в США — 0,39, в Австралії — 0,38 %. Із наведених даних видно, що фактори, які впливають на появу однояйцевих близнят, майже не залежать від умов зовнішнього середо­вища.
Частота народження дизиготних близнят різна у різних країнах і має значні коливання. Наприклад, в Да­нії—1,02%, в Італії — 0,86 %, в США—0,61%, в Австралії—0,77%, в Японії — 0,23, в Південній Африці — 2,23 %. Таким чином, якщо в Японії на 10000 народжень приходиться 23 пари двояйцевих близнят, то в Півден­ній Африці — 223. Причини такої різ­ниці невідомі, проте цей факт свідчить про вплив факторів середовища. У старших вікових групах народження дизиготних близнят зустрічається час­тіше. Дослідження показали, що певну роль у народженні близнят має спад­кова схильність до багатоплідної ва­гітності. Відомі випадки повторного на­родження близнят у одній сім'ї. На протязі останніх десятиріч кількість близнят знижується, причому це зни­ження стосується переважно двояйце­вих близнят.
Монозиготні близнята розвиваються із роз'єднаних бластомерів, які утвори­лися після дробіння однієї заплідненої яйцеклітини і, отже, мають однакоііий генотип. Монозиготні близнята при нормальному ембріональному розвит­ку завжди однієї статі. У більшості випадків у них є одна плацента, проте не завжди можна зробити висновок про зиготність близнят на підставі на­явності однієї чи двох плацент. Якщо розділення відбувається на протязі перших п'яти днів після запліднення, то кожний зародок буде мати власну плідну оболонку і плаценту. Цей ва­ріант зустрічається приблизно у 25 % однояйцевих близнят.
Якщо розщеплення відбувається на стадії розвиненої морули (5—12-й день), тоді однояйцеві близнята мають одну плаценту. Якщо ж процес розщеп­лення запізнюється і відбувається піс­ля ІЗ—15-го дня, то часто повного ро­з'єднання монозиготних близнят не відбувається і виникають різні дефор­мації, зрощення і каліцтва. Прикладом може бути народження в Сіамі (тепе­рішній Таїланд) у 1811 р. двох близ­нят хлопчиків, які зрослися грудьми. Згодом всі близнята, які зрослися якоіо-небудь частиною тіла, стали на­зиватися сіамськими. Енг і Чанг про­жили 63 роки, стан медицини в ті роки не давав можливості зробити операцію їх роз'єднання. Спроби роз'єднання зрослих близнят пов'язані з великим ризиком, проте на сьогодні відомі ви­падки вдалих операцій. Причини на­родження двояйцевих близнят — одно­часне дозрівання двох і більше яйце­клітин. Це може статися у одному яєчнику або у обох. У деяких жінок бу­вають множинні овуляції. Певну роль в цьому відіграє спадкова схильність, але не можна відкидати і вплив навко­лишнього середовища.
Народження трьох, чотирьох і біль­ше дітей у людини трапляється рідко. У 1934 р. в Канаді народились 5 дів­чаток, у 1974 р. в Гданську — 3 хлоп­чика і дві дівчинки, які нормально рос­ли і розвивались. Відомий випадок на­родження 5 дітей в Японії у 1981 р. У 1980 р. в Італії у 28-річної жінки на­родилось 6 дітей (дві дівчинки і чоти­ри хлопчика). З генетичної точки зору двояйцеві близнята подібні як звичай­ні сибси, але на відміну від останніх у них більша спільність факторів при внутрішньоутробному (пренатальному) і частково постнатальному періодах розвитку.
У перший період застосування цього методу проводили порівняння близнят за зовнішніми морфологічними ознака­ми: колір волосся, очей, пігментація шкіри, форма носа, очей, губ, вушних раковин, візерунок пальців тощо. Ці ознаки, як відомо, спадково зумовлені. Якщо досліджувана ознака проявляєть­ся у обох близнят пари, їх називають конкордантними (лат. — бути згідним, подібним). Конкордант-ність — це відсоток подібності за дос­ліджуваною ознакою. Відсутність озна­ки у одного із близнят — дискордантність.
На сьогодні для точнішого визначен­ня зиготності крім морфологічних ознак використовують дослідження груп крові (за системою АВО, Rh, МN) і білків плазми крові.
Хоч жодна з цих ознак сама по собі не достатня, але у комплексі вони да­ють можливість визначити зиготність близнят. Між монозиготними близня­тами можлива трансплантація органів, відторгнення не відбувається.
Близнюковий метод використовуєть­ся у генетиці людини для того, щоб оцінити ступінь впливу спадковості і середовища на розвиток якої-небудь нормальної або патологічної ознаки. Оскільки у монозиготних близнят од­накові генотипи, то наявні відмінності викликаються умовами середовища у період або внутрішньоутробного роз­витку, або формування організму піс­ля народження. Великий інтерес для вирішення ряду питань мають випад­ки, коли партнери за якихось причин росли і виховувалися у різних умовах. Прояв конкордантності ряду фізіоло­гічних ознак у такому випадку пояс­нюється впливом генотипу. З іншого боку, різнояйцеві близнята дозволяють проаналізувати інший варіант: умови середовища (коли близнята живуть по­ряд) однакові, а генотипи у них різні.
Вже з простого співставлення наве­дених даних видно, що такі ознаки, як групи крові, колір волосся і очей, повністю визначаються геноти­пом. У відношенні багатьох інших оз­нак висновки не такі явні, але поміт­но, що навіть деякі інфекційні хвороби (поліомієліт, туберкульоз) хоч і викли­каються факторами вірусної або бак­теріальної природи, у деякій мірі зале­жать від спадкової схильності. Для оцінки ролі спадковості у розвитку тієї чи іншої ознаки роблять розрахун­ки за формулою % подібності ОБ — % подібності ДБ,
100 — % подібності ДБ
де Н — коефіцієнт спадковості (англ. heredity —спадковість), ОБ—одно- і ДБ — двояйцеві близнята.
При Н, що дорівнює одиниці, ознака цілком визначається спадковим компо­нентом; при Н, що дорівнює нулю, виз­начальну роль відіграє вплив середо­вища. Коефіцієнт, який близький до 0,5, свідчить про приблизно однаковий вплив спадковості і середовища на формування ознаки.
Наведемо конкретний приклад. Кон-кордантність монозиготних близнят за шизофренією дорівнює 70 %, дизи-готних— ІЗ °/о. Тоді
H = 70-13 = 0.65, або 65%
100-13
Вплив середовища визначається фор­мулою С-ІОО % —Н. Тоді С-100% - 65 % = 35%. Отже, у наведеному ви­падку переважає вплив спадковості, але суттєву роль відіграють і умови середовища.
Інший приклад: група крові у моно­зиготних близнят співпадає у 100 % випадків, а у дизиготних — у 45%, тобто ця ознака повністю визначається генотипом.
На підставі даних табл. 7 видно, що для багатьох захворювань поряд із спадковим компонентом значну роль відіграють умови середовища, при яких відбувається реалізація генотипу у фе­нотипі.
Метод дерматогліфіки. Дерматоглі­фіка (гр. derma—шкіра, qliphe—ма­лювати) —це вивчення рельєфу шкіри на пальцях, долонях і підошвах. На відміну від інших частин тіла тут є епідермальні виступи — гребені, які утворюють складні візерунки. Ще у давнину у Китаї і Індії звернули ува­гу на те, що візерунки на пальцях і долонях строго індивідуальні, і корис­тувалися відбитками пальців замість підписів. На землі немає людей з од­наковими малюнками на пальцях (крім монозиготних близнят). У 1892 р. Ф. Гальтон запропонував класифікацію цих візерунків, яка дозволила викорис­товувати метод для ідентифікації осо­би у криміналістиці. Таким чином, ви­ділився один із розділів дерматогліфі­ки — дактилоскопія (вивчення візерун­ків на подушечках пальців). Інші роз­діли дерматогліфіки — пальмоскопія (малюнки на долонях) — плантоскопія (вивчення дерматогліфіки підошв).
Дактилоскопія. Гребені на шкірі пальців рук відповідають сосоч­кам дерми (від лат. — сосо­чок), тому їх називають також папі­лярними лініями, рельєф цих виступів повторює шар епідермісу. Міжсосочкові заглибини утворюють борозенки. На поверхні гребенів відкриваються вивід­ні протоки потових залоз, а у товщині сполучнотканинного сосочка знахо­дяться чутливі нервові закінчення. По­верхня, яка вкрита гребінчастою шкі­рою, відрізняється високою дотиковою чутливістю.
Закладка візерунків відбу­вається між 10 і 19 тижнями внутрішньоутробного розвитку; у 20-тижневих плодів уже добре помітні форми візе­рунків розгалуження нервових воло­кон.
Повне формування деталей будови дотикових візерунків завершується до шести місяців, після чого вони зали­шаються незмінними до кінця життя. При пошкодженні шкіри (опік, відмо­рожування, травми) їх малюнок через деякий час повністю відновляється до деталей. Звичайно, відновлення мож­ливе до тих пір, доки пошкодження не пов'язане з глибокою травмою, яка тя­гне утворення рубців із щільної спо­лучної тканини.
Дерматогліфічні дослідження мають важливе значення у визначенні зиготності близнят, у діагностиці деяких спадкових хвороб, у судовій медицині, у криміналістиці для ідентифікації особи. Папілярні лінії на подушечках пальців звичайно вивчають на відбит­ках, які наносять на папір після зма­щування пальців друкарською фарбою. Детальне дослідження візерунків про­вадять за допомогою лупи. Папілярні лінії різних напрямків ніколи не пере­тинаються, але можуть у певних пунк­тах зближуватися, утворюючи трирадіуси, або дельти (за подібністю фігу­ри до грецької літери). На подушеч­ках пальців розрізняють лінії цент­рального візерунку і лінії рамки, які облямовують центральний візерунок. Не дивлячись на індивідуальну непов­торність візерунків, виділяють три основних типи їх: дуги А (англ. аrch—дуга); петлі L (англ. Lor —пет­ля) і завиткові візерунки W (англ. whorl — завиток). Дугові візерунки зу­стрічаються рідше решти (6%), у цьо­му візерунку є лише один напрям па­пілярних ліній. Починаючись з одного краю візерунку, лінії, піднімаючись до іншого, протилежного краю, утворю­ють дуговий, шатровий візерунок, ви­гин якого буває або крутим, або поло­гим. Петлеві візерунки найбільш поши­рені (близько 60%). Це замкнений з одного боку візерунок: гребені почи­наються також від краю візерунка, але, не доходячи до протилежного краю, згинаються у вигляді петлі і по­вертаються до того ж краю, від якого починались. Якщо петля відхиляється у бік променевої кістки, вона назива­ється радіальною, якщо у бік ліктьо­вої кістки—ульнарною (Lr, Lu).

Завиткові візерунки займають серед­нє місце за поширеністю (34 %). Вони мають вигляд концентричних кіл, ова­лів, спіралей, знизу і зверху централь­на частина візерунка облямована дво­ма напрямками ліній. Завитки мають дві дельти. Типи пальцевих візерунків і їх запис приведені на мал. 5.5. На пальцях ніг є також три типи візерун­ків, але у іншому процентному співвід­ношенні (більший процент дуг). Так­тильні візерунки на підошві у людини редуковані у порівнянні з мавпами і займають меншу площу. Кількісним показником демотогліфіки є підрахунок гребенів (кількість папілярних ліній між дельтою і центром візерунка). У середньому на одному пальці буває 15-20 гребенів, на всіх десяти пальцях у чоловіків ця цифра дорівнює 144,98+- 51,08, а для жінок – 127,23+-52,21.

Біохімічні методи використовуються для діагностики хвороб обміну речо­вин, причиною яких є зміни активності окремих ферментів. За допомогою біо­хімічних методів відкрито близько 5000 молекулярних хвороб, які є нас­лідком прояву мутантних генів. При різних типах захворювання вдається або визначити сам аномальний білок — фермент, або проміжні продукти обмі­ну. Ці методи дуже трудомісткі, вима­гають спеціального обладнання і тому не можуть бути використані для масо­вих популяційних досліджень з метою раннього виявлення хворих із спадко­вою патологією обміну.
Останніми роками у різних країнах розробляються і використовуються для масових досліджень спеціальні програ­ми. Перший етап такої програми поля­гає у тому, щоб серед великої кількос­ті обстежуваних виділити ймовірно хворих, які мають якесь спадкове від­хилення від норми. Така програма на­зивається просіюючою, або скринінг-програмою (англ. sreening — просію­вання). Для цього етапу звичайно ви­користовується невелика кількість про­стих, доступних методик (експрес-ме­тодів). Експрес-методи грунтуються на простих якісних реакціях виявлення продуктів обміну у сечі, крові. На дру­гому етапі проводиться уточнення (під­твердження діагнозу або відхилення при хибно-позитивній реакції на пер­шому етапі). Для цього використову­ються точні хроматографічні методи визначення ферментів, амінокислот тощо.
Використовують також мікробіоло­гічні тести, які грунтуються на тому, що деякі штами бактерій ростуть тіль­ки на середовищах, які містять певні амінокислоти, вуглеводи. Вдалося от­римати штами за речовинами, які є субстратами або проміжними метабо­літами у хворих при порушенні обмі­ну. Якщо у крові або сечі є необхідна для росту речовина, то у чашці Петрі навколо фільтрувального паперу, про­соченого однією з цих рідин, спостері­гається активне розмноження мікро­бів, чого не буває у випадку аналізу у здорової людини. Розробляються різні варіанти мікробіологічних методів.
Популяційно-статистичний метод до­зволяє вивчати поширення окремих генів у популяціях людей. Звичайно проводиться безпосереднє вибіркове дослідження частини популяції або вивчають архіви лікарень, пологових будинків, а також проводять опитуван­ня шляхом анкетування. Вибір спосо­бу залежить від мети дослідження. Останній етап полягає у статистично­му аналізі.
Одним з найбільш простих і універ­сальних методів є метод, запропонова­ний Г. Харді і В. Вайнбергом (див. гл. II). Є і ряд інших спеціальних мате­матичних методів. У результаті цього можна визначити частоту генів у різ­них групах населення, частоту гетеро­зиготних носіїв ряду спадкових анома­лій і хвороб.
Досліджувані популяції можуть роз­різнятися за біологічними ознаками, географічними умовами життя, еконо­мічним станом. Вивчення розповсюдженості генів на певних територіях по­казує, що їх можна розділити на такі категорії: 1) мають універсальну по­ширеність (до них відноситься біль­шість відомих генів); це рецесивні гени фенілкетонурії і деяких інших форм розумової відсталості, які зуст­річаються у гетерозиготному стані у І % населення Європи; ген дальтоніз­му, який проявляється у 7 % чоловіків і 0,5 % жінок, але у гетерозиготному стані цей ген мають ІЗ % жінок; 2) зу­стрічаються локально, переважно у певних районах; наприклад, ген серпо­подібно-клітинної анемії, який пошире­ний у країнах Африки і Середземномо­р'я; ген, що зумовлює природжений вивих стегна, має високу концентрацію у корінного населення північно-східної частини Євразії.
Популяційно-статистичний метод до­зволяє визначити генетичну структуру популяцій (співвідношення між часто­тою гомо- і гетерозигот). Нові можливості для проведення генетичного ана­лізу відкриває використання електрон­но-обчислювальної техніки. Знання ге­нетичного складу популяцій населення має велике значення для соціальної гі­гієни і профілактичної медицини.
Патогенетичний метод. Принципи цитогенетичних досліджень сформува­лися на протязі 20—30-х років на кла­сичному об'єкті генетики — дрозофілі і деяких рослинах. Метод грунтується на мікроскопічному дослідженні хро­мосом.
Нормальний каріотип людини вклю­чає 46 хромосом, із них 22 пари ауто-сом і 2 статеві хромосоми. До 1956 р. кількість хромосом у людини не була точно встановлена, це вдалося шведсь­ким вченим Д. Тийо і А. Левану. На цей час у лабораторії успішно культи­вувалися клітини людини (клітини кі­сткового мозку, культури фібробластів або лейкоцитів периферичної крові, по­діл яких стимулювали фітогемаглюти-ніном). Використанням колхіцину зу­пиняли процес мітозу на стадії мета­фази, оскільки інактивувалися нитки мітотичного веретена; потім клітини оброблялися гіпотонічним розчином. У результаті набрякання і розривання клітинних мембран хромосоми виявля­лися вільними і віддаленими одна від одної (метафазні пластинки). Це дає можливість підраховувати їх і аналі­зувати. Найважливіше завдання поля­гає в умінні розрізняти індивідуальні хромосоми у даній метафазній плас­тинці. Безпосередньо, шляхом візуаль­ного спостереження під мікроскопом це зробити важко, тому звичайно роб­лять мікрофотографії, а потім вирі­зають окремі хромосоми і розташову­ють їх у порядку зменшення розмірів, тобто каріограми.
Для ідентифікації хромосом застосо­вують кількісний морфометричний ана­ліз. З цією метою проводять вимірю­вання довжини хромосоми у мікромет­рах. Визначають також співвідношен­ня довжини короткого плеча до довжи­ни всієї хромосоми (центромерний індекс).
У 1960 р. була розроблена перша Міжнародна класифікація хромосом людини (Денверська). У основу її бу­ли покладені особливості розмірів хро­мосоми і розташування первинної пе­ретяжки. Схематичне зображення ти­пів метафазних хромосом людини по­дано на мал. 5.7. За формою і загаль­ними розмірами всі хромосоми люди­ни поділяються на 7 груп, які позна­чають латинськими літерами А, В, С, О, Е, Р, О. Всі хросоми мають поряд­кові номери. Найбільша пара гомоло­гічних хромосом має № 1, наступна — № 2 тощо (табл. 7). Найменші із хро­мосом людини—№ 21 і 22. Статеві хромосоми позначаються літерами — велика Х (група С) і маленька У (гру­па 0). В останній час розробляються напівавтоматичні системи для вимі­рювання і кількісного аналізу хро­мосом.
Проте ідентифікація хромосом тіль­ки за вказаними ознаками зустрічає великі труднощі. Фактично вдається хромосома, а у межах групи визна­чити її місце і номер часто не вдаєть­ся. Згодом положення Денверської кла­сифікації були розвинуті, доповнені новими критеріями і конкретизовані на наступних міжнародних конференціях, останньою із яких була Паризька IV конференція по стандартизації хро­мосом людини (1971). Були використа­ні принципово нові методичні прийоми. У 1968—1970 рр. були опубліковані ро­боти шведського генетика Касперссона, який застосовував для вивчення хромосом флуоресцентні барвники, зок­рема акрихін — іприт і його похідні. Наступне вивчення у люмінісцентному мікроскопі показало, що хромосоми не дають рівномірного світіння по дов­жині.
Однорідність хромосом, яку спосте­рігали при використанні звичайних ядерних барвників, не підтвердилась, у них виділяється кілька яскравих смуг, які співпадають з локалізацією структурного гетерохроматину. Крім великих, дуже флуоресціюючих діля­нок, кожна хромосома має диски, які чергуються. Цей малюнок світіння строго специфічний для кожної хромо­соми. Після видалення із хромосом ДНК вони втрачають майже повністю здатність до флуоресценції. При ви­вченні каріотипу багатьох видів ссавців з'ясувалось, що здатністю до акрихі-нової флуоресценції характеризуються хромосоми людини, горили і шимпанзе. У інтерфазних ядрах цим методом ви­являється У-хромосома, яка має вигляд зеленуватого тільця, яке яскраво сві­титься.
На сьогодні розроблено кілька ме­тодів виявлення структурної неоднорід­ності по довжині хромосом людини. Основу всіх методів складають дена­турації і ренатурації ДНК хромосом, які відбулися на препаратах. Якщо після денатурації ДНК (викликаної одним із факторів) згодом провести її ренатурацію — відновлення вихідної двониткової структури, а потім зафар­бувати хромосоми фарбою Гімзи, то у них виявиться чітке диференціювання на темно і світло зафарбовані смуги — диски. Послідовність розташування цих дисків, їхній малюнок строго спе­цифічний для кожної хромосоми. У ре­зультаті різних варіантів методу вда­ється виявити центромерний і біля-центромерний гетерохроматин (С-диски), диски, які розташовані вздовж хромосоми (власне Гімзи-диски, С-диски).
Значний вклад у вивчення хромосом зроблений російськими цитогенетика­ми О. О. Прокоф'євою-Бельговською, О. Ф. Захаровим. В Інституті медичної генетики АМН СРСР О. Ф. Захаровим був розроблений перспективний метод вивчення хромосом. В його основу по­кладено процес неодночасної репліка­ції хромосом: одні ділянки реплікують-ся раніше, у інших цей процес затри­мається і реплікація відбувається знач­но пізніше. Неодночасно іде процес спіралізації хромосом, які вступають у мітоз. Проте до того моменту, коли хромосоми вступають у метафазу, всти­гає завершитись процес вирівнювання цих відмінностей, і ступінь конденсації метафазних хромосом стає однаковим. Було показано, що можна затримати цей процес шляхом введення 5-бромде-зоксиуридину (5-БДУ), який є анало­гом тимідину— попередника ДНК. Як­що 5-БДУ вводити в кінці 5-періоду, то він включається у синтез ДНК; ті ділянки хромосом, де знаходиться ця речовина, залишаються мало зафарбо­ваними, бо була затримана спіраліза­ція. Інтенсивно зафарбовуються ділян­ки (Р-диски), у яких процес репліка­ції відбувся рано і вони встигли спіралізуватися. Розташування світлих і темних дисків при цьому методі проти­лежне тому, що спостерігається при С-фарбуванні.
Порівняльний аналіз різних методів фарбування показав, що один і той же диск може виділятися як світлий, не­зафарбований або темнозафарбований, але порядок розташування дисків іден­тичний при всіх методиках (О-, С-, О-, Р-диски). Отже, не викликає сумніву, що їх розташування і послідовність мають закономірний характер, специ­фічний для кожної хромосоми (див. мал. 2,8). Природа цієї специфічної диференціації хромосом на диски ще повністю не з ясована, як і причини акрихінової флуоресценції ділянок хромосом. Припускають, що це пов'я­зано з наявністю у молекулі ДНК пов­торюваних блоків певної послідовності нуклеотидів або з особливостями зв'яз­ку ДНК з білками, що входять до складу хромосоми. З'ясування внут­рішньої структурної неоднорідності хромосом відіграло важливу роль у подальшому розвитку цитогенетики людини і покладено у основу міжна­родної номенклатури.
Якщо порушення виникають у стате­вих хромосом, то діагностика спрощу­ється. У цьому випадку проводиться не повне каріотипування, а застосо­вується метод дослідження статевого хроматину у соматичних клітинах.
Статевий хроматин—це не­велике дископодібне тільце, яке інтен­сивно фарбується гематоксиліном та іншими лужними барвниками. Воно виявляється у інтерфазних клітинних ядрах ссавців і людини, безпосередньо під ядерною мембраною. Статевий хроматин виявили вперше у 1949 р. М. Барр і Ч. Бертрам у нейронах кіш­ки; дослідники звернули увагу, що він є тільки у ядрах клітин самок і відсут­ній у самців.
Згодом було уточнено, що статевий хроматин є у більшості клітинних ядер самок (60—70 %), у самців його звичайно немає або зустрічається ду­же рідко (3—5 %). У клітинах чолові­ків іноді можна бачити дуже невелику кількість несправжніх тілець статевого хроматину—це конденсовані ділянки аутосом і спіралізовані У-хромосоми. Вони значно менші від X-хроматину і відрізняються за формою, розташуван­ням і кількістю. Статевий хроматин являє собою спіралізовану X-хромосо­му, яка у жінок інактивується ще у ранньому ембріогенезі до розвитку статевих залоз. Інактивацією однієї з X-хромосом вирівнюється баланс генів статевих хромосом у клітинах організ­мів чоловічої і жіночої статі.
Статевий хроматин можна визначи­ти у будь-яких тканинах. Частіше всьо­го досліджуються епітеліальні клітини слизової оболонки щоки (буккальний зскрібок). Це особливо зручно при ма­сових дослідженнях.
У каріотипі нормальної жінки є дві X-хромосоми, і одна із них утворює тільце статевого хроматину. Кількість тілець статевого хроматину у людини та інших ссавців на одиницю менша, ніж число Х-хромосом у даної особини. У жінок, які мають каріотип ХО (мо-носомія-^, синдром Шерешевського — Тернера), ядра клітин не мають стате­вого хроматину. При синдромі трисомії -X у жінки утворюються два тільця, у чоловіка з каріотипом 47 (ХХУ) — є одне тільце (як у нормальних жінок).
Статевий хроматин можна визначи­ти і на мазках крові, у ядрах нейтрофі-лоцитів; вони мають характерний виг­ляд барабанних паличок, які відходять від складно-дольчастого ядра цих лей­коцитів. У нормі у жінок ці структури виявляються у 3—7 % нейтрофілоцитів, у чоловіків вони взагалі відсутні. Де­які автори вважають, що цей метод більш достовірний, ніж буккальний зскрібок, але внаслідок великої трудо­місткості він використовується тільки при спеціальних дослідженнях.
Визначення статевого хроматину ви­користовують і у судовій медицині, ко­ли необхідно за плямами крові встано­вити статеву належність, при аналізі, коли необхідно встановити, чоловікові чи жінці належить знайдена частина трупа, навіть через тривалий термін після смерті.
При трансплантації тканин тільце статевого хроматину є своєрідною міт­кою (якщо донор і реципієнт різної статі). Аналіз дає можливість прослід­кувати приживання чи розсмоктування трансплантату.
Виявлення Y-хроматину впроваджу­ється у практику медико-генетичних консультацій.

Мутації та їхні прояви у фенотипі людини. Поняття про спадкові хвороби. У людини, як і у інших хромосомні хвороби, а захворювання, які зв'язані з мутаціями на молекуляр­ному рівні, називають генними хворо­бами.
Успадкування резус-фактора. У макак-резус із еритроцитів у 1940 р. виділено антиген, який назвали резус-фактором (Rh-фактор). Згодом він був знайдений і у людей. Близько 85 % європейців його мають, тобто є резус-позитивними (Rh+), а у 15% резус-негативних (Rh-) він відсутній.
У нормі в осіб з резус-негативною кров'ю не виробляються антитіла до резус-фактора, але вони почнуть вироблятися у результаті переливан­ня резус-позитивної крові як захис­на реакція проти чужорідного анти­гена.
Успадкування резус-фактора зумов­лене трьома парами генів —С, D, К, які тісно зчеплені між собою, тому практично успадкування його частіше всього імітує моногенне успадкування.
Резус-позитивний фактор зумовле­ний домінантними генами. При шлюбі жінки з резус-негативною кров'ю і чо­ловіка з наявністю резус-фактора за умови гомозиготності батька всі діти будуть резус-позитивними, а при гетерозиготності буде спостерігатися роз­щеплення у відношенні 1 : 1.
Якщо у жінки з резус-негативною кров'ю дитина, що народиться, успад­кує резус-фактор, перша вагітність може завершитись цілком нормаль­но. Але при цьому у кров'яному руслі матері утворюються антитіла до Rh+-фактора. При наступній вагітнос­ті ці антитіла проникають у кров пло­да і викликають руйнування еритро­цитів, які мають антиген Rh+. З кож­ною наступною вагітністю, несуміс­ною за антигенами, кількість антитіл до Rh+-фактора у тілі матері зростає (мал. 5.11 і 5.12). Іноді гинуть недо­ношені ембріони, спостерігається мертвонародження. У зв'язку з проникан­ням у кров'яне русло дитини антитіл у неї розвивається гемолітична хворо­ба, що призводить до руйнування ери­троцитів. Врятувати новонароджено­го може тільки термінове переливан­ня крові з повною її заміною.
Із сказаного також має бути зрозу­мілим, що для переливання крові не­обхідно досліджувати її на Rh-фактор. Переливання несумісної за цим фактором крові дівчатам і жінкам зо­всім недопустиме, бо може викликати безпліддя.

Поиск по сайту: